Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas a una célula.

Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

(a) una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos 5 que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en que:

(i) el resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de glutamina; y

(ii) el resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de arginina,

teniendo dicho fragmento la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa; o,

b) una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, por:

(i) la sustitución del resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de glutamina;

(ii) la sustitución del resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de arginina; y

(iii) de 1 a 50 sustituciones adicionales;

consistiendo el polipéptido en dicha secuencia que tiene la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad a translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas a una célula La invención se refiere a polipéptidos adecuados para su uso en el suministro de una o más moléculas a una célula.

En particular, la invención se refiere a polipéptidos adecuados para su uso en el suministro de una o más moléculas que son capaces de provocar una respuesta inmune en un hospedador, abordando células que expresan el receptor CD11b/CD18 (también mencionadas en este documento como "células que expresan CD11b") .

La invención se refiere más particularmente a polipéptidos derivados de una proteína adenilato ciclasa (CyaA) , usándose ésta última en forma de una toxina o de una proteína destoxificada o toxoide, que son polipéptidos mutantes. Dichos polipéptidos mutantes son capaces de retener la actividad de unión de CyaA nativa al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo y preferiblemente también de retener la actividad de translocación de CyaA nativa a través de su dominio N-terminal en dichas células y además tienen una actividad de formación de poro que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

La invención se refiere en particular al uso de dichos polipéptidos como vectores proteicos. Por consiguiente los polipéptidos mutantes se combinan adicionalmente con moléculas no CyaA, dando lugar de este modo a derivados polipeptídicos, donde dichas moléculas tienen un interés preventivo de vacuna y/o terapéutico cuando se administra a un hospedador.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención son adecuados para su uso como vectores proteicos para el suministro de una molécula, en particular de una molécula polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más epítopos, especialmente antígenos, a una célula, especialmente en células que expresan CD11b.

La invención por tanto también se refiere a un derivado polipeptídico (un derivado del polipéptido mutante de la invención) que comprende o consiste en un polipéptido mutante de acuerdo con la invención recombinado con una o más moléculas, en particular con una o más moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune, constituyendo de este modo un polipéptido recombinante o un polipéptido de fusión. La invención también se refiere a derivados polipeptídicos obtenidos injertando químicamente dicha molécula o moléculas en los polipéptidos mutantes.

De acuerdo con una realización, los derivados polipeptídicos de acuerdo con la invención son adecuados para su uso en tratamiento profiláctico y especialmente en vacunación y en terapia incluyendo en inmunoterapia, en particular para provocar una respuesta inmune en un sujeto.

La CyaA nativa usada en el contexto de la presente invención para el diseño de los polipéptidos de la invención es la adenilato ciclasa producida en Bordetella pertussis y que tiene las siguientes características y propiedades descritas con el propósito de caracterizar dicha proteína en el contexto de la invención.

La toxina adenilato ciclasa-hemolisina RTX bi-funcional (también denominada en este documento como toxina adenilato ciclasa (CyaA, ACT, o AC-Hly) es un factor de virulencia clave de Bordetella pertussis que es el agente causante de la tos ferina (1) . Su polipéptido de 1706 restos de longitud es una fusión de un dominio o parte enzimática adenilato ciclasa (AC) N-terminal (∼400 restos) a una hemolisina RTX de formación de poros (Repetición en ToXina citolisina) de ∼1306 restos que constituye la parte o dominio C-terminal (2) . El último alberga los sitios de activación de proCyaA en CyaA por palmitoilación post-traduccional covalente de grupos grupos ε-amino de Lys860 y Lys983, así como las numerosas repeticiones RTX que forman ∼40 sitios de unión de calcio, cuya carga es necesaria para la actividad citotóxica de CyaA (3, 4) . La proteína CyaA de hecho se sintetiza como una protoxina inactiva que se convierte en una toxina activa por palmitoilación post-traduccional de dos restos internos de lisina (lisinas 860 y 983) . Esta modificación post-traduccional requiere la expresión con el gen mCyaA, de un gen accesorio, es decir, cyaC que está localizado cerca de CyaA en el cromosoma de B. pertussis.

La toxina principalmente aborda fagocitos mieloides hospedadores que expresan el receptor de integrina αMβ2, conocido también como CD11b/CD18, CR3 o Mac-1 (5) . Dicha toxina se une especialmente al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo a través de una sitio de unión a receptor presente en su parte Cterminal. Estas células por consiguiente son células diana para la toxina nativa y también para los polipéptidos de la invención. CyaA se inserta en la membrana citoplasmática de células y transloca el dominio enzimático AC al citosol de dichas células diana (6, 7) . Dentro de las células, la AC se activa por calmodulina y cataliza la conversión no controlada de ATP celular en AMPc, una molécula de segundo mensajero clave que proporciona alteración de las funciones bactericida de los fagocitos (1) . A dosis elevadas (>100 ng/ml) , la disipación catalizado por CyaA de ATP en AMPc se convierte en citotóxica y promueve la apoptosis o incluso una muerte necrótica rápida y lisis de monocitos CD11b+ (8, 9) .

Recientemente, los inventores demostraron que CyaA se une a oligosacáridos N-ligados de su receptor CD11b/CD18 (10) . Esto sugiere que las interacciones de baja especificidad con glucanos de proteínas o glucolípidos de superficie celular ubicuas pueden suponer una capacidad aproximadamente dos órdenes de magnitud reducida pero fácilmente detectable de CyaA para penetrar también en células que carecen de CD11b/CD18. De hecho, debido a la actividad catalítica específica extremadamente elevada del dominio AC, se descubrió que CyaA eleva sustancialmente el AMPc también en eritrocitos, linfocitos, linfoma, neuroblastoma, CHO, o células epiteliales de la tráquea de mamíferos y aves (1, 11) .

Ya se ha propuesto en la técnica previa proporcionar toxina destoxificada también llamada toxoide, donde la actividad adenilato ciclasa está disminuida, especialmente suprimida esencialmente. Dicho toxoide CyaA/AC -puede usarse para conseguir la preparación de los polipéptidos de la invención.

Además de elevar el AMPc, la toxina muestra también una actividad hemolítica moderada en eritrocitos de mamíferos y aves. Esto se debe a la capacidad de formar poros selectivos de cationes pequeños de un diámetro estimado de 0, 6 a 0, 8 nm, que permeabilizan la membrana celular y finalmente provocan la lisis celular coloideosmótica (12) . Recientemente, los inventores y otros han demostrado que la actividad de formación de poros de CyaA sinergiza con su actividad enzimática AC invasiva de células y contribuye a la potencia citolítica global de CyaA sobre células CD11b+ (13, 14) . Debido a una capacidad intacta de formación de poros (hemolítica) , en ausencia de osmoprotectores tales como suero, el toxoide CyaA/AC -enzimáticamente inactivo (15) aún muestra una actividad hemolítica completa sobre eritrocitos y una actividad citolítica residual, aproximadamente diez veces reducida sobre monocitos que expresan CD11b (8) , lo que establece un límite a su uso en terapia.

En seguida se descubrió que las actividades hemolítica (formación de poros) y AC de translocación de membrana (invasiva de células) de CyaA son disociables por concentración baja de calcio, temperatura baja (16) y por el grado y naturaleza de acilación de CyaA (4, 12, 17) . Además, la dos actividades difieren sustancialmente en sensibilidad a sustituciones de reversión de carga o neutras de glutamatos en las posiciones 509, 516, 570 y 581 dentro del dominio hidrófobo (8, 13, 18) . Las actividades invasiva de células y de formación de poros de CyaA por tanto se propusieron como mutuamente independientes y de funcionamiento en paralelo en membrana de células diana. El modelo ilustrado en la figura 5A, sugiere que dos confórmeros CyaA distintos se insertan en la membrana de células diana en paralelo, siendo uno el precursor de translocación, que supone el suministro del dominio AC a través de la membrana celular con flujo entrante concomitante de iones calcio en las células, siendo el otro un precursor de poros que finalmente forma poros oligoméricos (13, 18, 19) .

Los inventores ahora han ensayado esto modelo y los han refinado, demostrando que la actividad de formación de poros no está implicada en la translocación del dominio AC a través de la célula diana.

En la presente invención, los inventores inicialmente diseñaron polipéptidos mutantes CyaA, basándose en la adenilato... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

(a) una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en que:

(i) el resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de glutamina; y

(ii) el resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de arginina,

teniendo dicho fragmento la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa; o, b) una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, por:

(i) la sustitución del resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de glutamina;

(ii) la sustitución del resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de arginina; y

(iii) de 1 a 50 sustituciones adicionales;

consistiendo el polipéptido en dicha secuencia que tiene la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad a translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fragmento es de al menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 o 1600 restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1, de tamaño.

3. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un mutante de un toxoide de adenilato ciclasa cuya actividad adenilato ciclasa en células está parcial o totalmente suprimida en comparación con la de la toxina CyaA de Bordetella pertussis.

4. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha supresión parcial o total de actividad adenilato ciclasa se consigue por inserción de un dipéptido entre los restos aminoacídicos correspondiente a las posiciones 188 y 189 dela SEC ID Nº 1.

5. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos es la SEC ID Nº 2.

6. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es la secuencia de aminoácidos descrita como la SEC ID Nº 2 en que se ha insertado un dipéptido entre las posiciones 188 y 189, preferiblemente que es la secuencia de aminoácidos descrita como la SEC ID Nº 3.

7. Derivado polipeptídico que comprende o que consiste en el polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 adicionalmente combinado con una o más moléculas de interés.

8. Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 7, en el que cada una de dichas una o más moléculas de interés consiste en una secuencia de aminoácidos adecuada para provocar una respuesta inmune.

9. Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune consiste en 5 a 800 especialmente 300 a 600, o 400 a 500 restos aminoacídicos.

10. Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la influenza, una secuencia del virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o comprende o consiste en una parte de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos antígenos que comprende al menos uno epítopo.

11. Derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que es un polipéptido recombinante en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune se inserta en un sitio permisivo de dicho polipéptido, siempre que se conserve la capacidad

de dicho polipéptido de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal en las células que expresan CD11b/CD18.

12. Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que cada una de dichas secuencias de aminoácidos adecuadas para provocar una respuesta inmune está injertada, especialmente injertada químicamente, en un resto de aminoácido de dicho polipéptido.

13. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para su uso en terapia.

14. Polipéptido o derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en terapia para provocar una respuesta inmune de células T y/o para provocar una respuesta inmune de células B en un hospedador que lo necesite.

15. Derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas, por parásitos o fúngicas.

16. Polipéptido o derivado polipeptídico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho polipéptido tiene que administrarse en combinación con un adyuvante y/o en combinación con otra molécula terapéuticamente activa.

17. Polipéptido o derivado polipeptídico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho polipéptido no tiene que administrarse en combinación con un adyuvante.

18. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante y/o una molécula terapéuticamente activa.

19. Uso de un derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad seleccionado entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas, por parásitos o fúngicas.

20. Método para la preparación de un vector proteico adecuado para el suministro de una molécula a una célula que expresa CD11b/CD18 que comprende unir dicha molécula a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13