Perfil de expresión de microARN asociado con cáncer de páncreas.

Un método para diagnosticar si un sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar,

adenocarcinoma ductalpancreático, que comprende medir el nivel de un producto génico de miR que es una forma precursora o madura deMIR-021 (SEC ID Nº: 32) en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que un aumento en elnivel del producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miRcorrespondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o estáen riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático.

Perfil de expresión de microARN asociado con cáncer de páncreas

Antecedentes El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. La tasa de mortalidad anual en los últimos cinco años ha sido de aproximadamente 30.000, con un número similar de nuevos casos diagnosticados cada año. El diagnóstico para el cáncer de páncreas es el peor de todos los tipos de cáncer con una relación de mortalidad/incidencia de 0, 99. La incidencia del cáncer de páncreas en los Estados Unidos es de aproximadamente 9 por cada 100.000. Estas cifras desalentadoras, que reflejan las tasas de aumento de incidencia y de muerte, se deben a la falta de mejoras en las estrategias de detección y diagnóstico y la escasez de avances en los regímenes de tratamiento.

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes cortos que se han identificado en el genoma de una amplia gama de especies. Los miARN fueron descubiertos por primera vez en C. elegans en 1993 y posteriormente se han descubierto en todos los organismos pluricelulares. Los miARN son reguladores negativos de la expresión genética y se cree que actúan principalmente a través de interacciones imperfectas de pares de bases a secuencias dentro de la región sin traducir 3' de los mARN que codifican proteínas. Hacia 2006, se habían descubierto 326 miARN en seres humanos. Mientras que el papel de cada uno de estos miARN se desconoce, los miARN específicos han sido implicados en la regulación de una serie diversa de procesos celulares que incluyen diferenciación de adipocitos, maduración de ovocitos, mantenimiento del estado celular pluripotente y regulación de la secreción de insulina.

Un número creciente de evidencias directas e indirectas sugiere una relación entre la expresión de miARN alterado y

el cáncer. Estos incluyen miR-15a y miR-16-1 en leucemia linfocítica crónica, miR-143 y miR-145 en cáncer colorrectal, let-7 en cáncer de pulmón y miR-155 en linfoma difuso de linfocitos B grandes. La formación de perfiles de expresión se ha identificado en otros cánceres con expresión diferencial de varios miARN que incluyen cáncer de mama, glioblastoma y cáncer papilar de tiroides. Un policistrón que codifica cinco miARN está amplificado en linfomas de linfocitos B humanos y la expresión forzada del policistrón junto con c-myc fue tumorigénica, lo que sugiere que este grupo de miARN puede funcionar como oncogenes.

Se necesita un método para diagnosticar de forma fiable y precisa, o para la identificación sistemática de individuos con una predisposición al cáncer de páncreas. Además, es muy deseable un método para tratar el cáncer de páncreas.

Sumario La presente invención se basa, en parte, en la identificación de miARN que tienen una expresión alterada en el adenocarcinoma de páncreas.

La invención proporciona métodos, tal como se define en las reivindicaciones, para diagnosticar sin un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático, que comprende medir el nivel de un producto génico de miR que es un precursor o forma madura de MIR-021.

Tal como se define en las reivindicaciones, los métodos pueden comprender medir combinaciones de productos génicos de miR y/o productos génicos de miR adicionales.

Además, se desvelan productos génicos de miR con expresión alterada seleccionados entre los siguientes grupos: MIR-034b, MIR-092-2-P, MIR-096-P, MIR-129-2, MIR-130a-P, MIR-133b, MIR-139, MIR-188b-P, MIR-192, MIR200a-P, MIR-204, MIR-210, MIR-299-P, MIR-302d, MIR-337, MIR-371, MIR-378, MIR-383, MIR-422b, MIR-423, MIR375, let-7a-2-P, let-7b, let-7c, let-7d, let-7f-1, let-7i, MIR-001-2, MIR-007-1, MIR-015a, MIR-015b, MIR-016-1, MIR019b-1-P, MIR-021, MIR-023a, MIR-024-1, 2, MIR-027a, b, MIR-029a, c, MIR-030d, MIR-032, MIR-092-1, MIR-098, MIR-099a, MIR-100, MIR-107, MIR-125b-1, MIR-126, MIR-128a, MIR-132, MIR-136, MIR-142-P, MIR-145-P, MIR152, MIR-155, MIR-181a, c, MIR-196a-2, MIR-212, MIR-213, MIR-215, MIR-218-1, 2, MIR-221, MIR-222-P, MIR-301,

MIR-328, MIR-331-P, MIR-345, MIR-367, MIR-376, MIR-424 y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el nivel del producto génico en la muestra biológica es menor que el nivel de su producto génico de miR correspondiente en la muestra de control. Dichos productos génicos subexpresados incluyen: MIR-092-2-P, MIR-096-P, MIR-129-2, MIR-133b, MIR-139, MIR-188b-P, MIR-204, MIR-299-P, MIR-337, MIR-371, MIR-383, MIR375 y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica es mayor que el nivel de su producto génico de miR correspondiente en la muestra de control. Dichos productos génicos de miR sobrexpresados incluyen: let-7a-2-P, let-7b, let-7c, let-7d, let-7f-1, let-7i, MIR-001-2, MIR-007-1, MIR-015a, MIR-015b, MIR-016-1, MIR-019b-165 P, MIR-021, MIR-023a, MIR-024-1, 2, MIR-027a, b, MIR-029a, c, MIR-030d, MIR-032, MIR-092-1, MIR-098, MIR099a, MIR-100, MIR-107, MIR-125b-1, MIR-126, MIR-128a, MIR-132, MIR-136, MIR-142-P, MIR-145-P, MIR-152,

MIR-155, MIR-181a, c, MIR-196a-2, MIR-212, MIR-213, MIR-215, MIR-218-1, 2, MIR-221, MIR-222-P, MIR-301, MIR328, MIR-331-P, MIR-345, MIR-367, MIR-376, MIR-424, y combinaciones de los mismos.

Los métodos de la presente divulgación pueden incluir: (a) someter a ensayo los niveles de expresión de una pluralidad de productos génicos de miR en la muestra de ensayo para proporcionar un perfil de expresión de miR para la muestra de ensayo; y (b) comparar el perfil de expresión de miR de la muestra de ensayo con un perfil de expresión de miR correspondiente a partir de la muestra de control. Una diferencia entre el perfil de expresión de miR de la muestra de ensayo y el perfil de expresión de miR de la muestra de control es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de páncreas.

Los productos génicos de miR múltiples pueden corresponder a una parte básica del complemento total de genes de miR en una célula. En otras realizaciones, los productos génicos de miR múltiples corresponden a aproximadamente un 95 %, un 90 %, un 80 %, un 70 % o un 60 % del complemento total de genes de miR en una célula.

Los productos génicos de miR múltiples pueden incluir uno o más productos génicos de miR seleccionados entre el grupo que consiste en: MIR-139, MIR096-P, MIR-375, let-7b, let-7d, let-7f-1, let-7i, MIR-155, MIR-181a, MIR-212, MIR-301, MIR-007-1, y MIR-021.

En nivel de dicho producto génico de miR se puede medir usando diversas técnicas que son bien conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen ensayos basados en amplificación, ensayos basados en hibridación, y análisis de micromatrices. El nivel del producto génico de miR se puede determinar midiendo la correspondiente copia genética de miR en la muestra.

La muestra biológica obtenida a partir del sujeto puede incluir tejido pancreático, tumor pancreático o células 25 pancreáticas. La muestra biológica también puede incluir jugo pancreático.

Además, se desvela un kit para diagnosticar cáncer de páncreas en un sujeto que se sospecha que tiene, o que está en riesgo de desarrollar, cáncer de páncreas. Dicho kit incluye: (a) un medio para medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, y (b) un medio para comparar el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. Una diferencia detectada entre el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de páncreas.

Además, se desvela un método para identificar sistemáticamente un sujeto que está en riesgo de desarrollar cáncer de páncreas. Dicho método incluye evaluar el nivel de al menos un producto génico de miR, o una combinación de productos génicos de miR, asociados con el cáncer de páncreas en una muestra biológica obtenida a partir del páncreas del sujeto, en el que una alteración en el nivel del producto génico de miR, o combinación de productos génicos de miR, en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto está en riesgo de desarrollar cáncer de páncreas.

En una realización, la muestra biológica incluye tejido pancreático que es normal o se sospecha que es precanceroso.

Además, se desvela un método para inhibir la progresión del cáncer de páncreas en un sujeto cuyas células cancerosas de páncreas... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar si un sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático, que comprende medir el nivel de un producto génico de miR que es una forma precursora o madura de MIR-021 (SEC ID Nº: 32) en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que un aumento en el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende medir el nivel de una combinación de productos génicos de miR seleccionados entre formas precursoras o maduras del grupo de miR que se enumeran en la Fig. 16 en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que una disminución en el nivel de producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativa de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, 15 adenocarcinoma ductal pancreático en el caso de miR-148a, miR-216*, miR-217, miR-375 y miR-377; y en el que un aumento en el nivel de producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático en el caso de let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7 g, let-7i, miR-009*, miR-010a, miR-010b, miR-015a, miR-016, miR-017-3p, miR-017-5p, miR-018, miR-020, miR-022, miR-023a, miR-023b, miR-024, miR-026a, miR-027a, miR-027b, miR-028, miR-029b, miR-030e-3p, miR031, miR-034a, miR-034b, miR-034c, miR-093, miR-098, miR-099a, miR-099b, miR-100, miR-101, miR-103, miR106b, miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-126*, miR-127, miR-130a, miR-132, miR-135b, miR-140, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143, miR-145, miR-146, miR-146b, miR-148b, miR-149, miR-150, miR-152, miR-155, miR-181a, miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-183, miR-186, miR-189, miR-190, miR-191, miR-192, miR-193, miR-194, miR

195, miR-196a, miR-199a*, miR-199b, miR-200a, miR-200b, miR-203, miR-210, miR-212, miR-213, miR-214, miR218, miR-221, miR-222, miR-223, miR-296, miR-301, miR-324-3p, miR-324-5p, miR-330, miR-331, miR-338, miR339, miR-340, miR-342, miR-345, miR-346, miR-361, miR-370, miR-372, miR-374, miR-376a, miR-378, miR-379, miR-382, miR-422b, miR-423 y miR-425, y en el que la combinación incluye una forma precursora o madura de MIR

021.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende medir los niveles de una combinación de productos génicos de miR seleccionados entre formas precursoras o maduras del grupo de secuencias de miR que consisten en MIR-021 (SEC ID Nº: 32) , MIR-221 (SEC ID Nº: 172) , MIR-301 (SEC ID Nº: 178) , MIR-212 (SEC ID Nº: 161) , MIR-100 (SEC ID Nº: 69) , let-7i SEC ID Nº: 11) , MIR-222-P (SEC ID Nº: 173) , MIR-155 (SEC ID Nº: 124) , MIR-023a (SEC ID Nº: 35 34) , MIR-181a (SEC ID Nº: 125) , MIR-376 (SEC ID Nº: 210) , let-7a-2-P (SEC ID Nº: 2) , let-7b (SEC ID Nº: 4) , let-7c (SEC ID Nº: 5) , let-7d (SEC ID Nº: 6) , let-7f-1 (SEC ID Nº: 8) , MIR-001-2 (SEC ID Nº: 13) , MIR-007-1 (SEC ID Nº: 14) , MIR- 015a (SEC ID Nº: 22) , MIR-015b (SEC ID Nº: 23) , MIR-016-1 (SEC ID Nº: 24) , MIR-019b-1-P (SEC ID Nº: 29) , MIR-024-1, 2 (SEC ID Nº: 36, 37) , MIR-027a, b (SEC ID Nº: 42, 43) , MIR-029a, c (SEC ID Nº: 45, 46) , MIR-030d (SEC ID Nº: 53) , MIR-032 (SEC ID Nº: 56) , MIR-092-1 (SEC ID Nº: 61) , MIR-098 (SEC ID Nº: 66) , MIR-099a (SEC ID Nº: 67) , MIR-107 (SEC ID Nº: 78) , MIR-125b-1 (SEC ID Nº: 85) , MIR-126 (SEC ID Nº: 87) , MIR-128a (SEC ID Nº: 89) , MIR-132 (SEC ID Nº: 94) , MIR-136 (SEC ID Nº: 102) , MIR-145-P (SEC ID Nº: 112) , MIR-152 (SEC ID Nº: 120) , MIR-181c (SEC ID Nº: 126) , MIR-196a-2 (SEC ID Nº: 144) , MIR-213 (SEC ID Nº: 162) , MIR- 215 (SEC ID Nº: 164) , MIR-218-1, 2 (SEC ID Nº: 167, 168) , MIR-328 (SEC ID Nº: 189) , MIR-331-P (SEC ID Nº: 191) , MIR-345 (SEC ID Nº: 198) , MIR-367 (SEC ID Nº: 201) y MIR-424 (SEC ID Nº: 221) , en el que un aumento en el nivel del producto génico

de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma de páncreas, y en el que la combinación incluye una forma precursora o madura de MIR-021.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el grupo de secuencias de miR consiste en let-7b, let-7c, let-7d, let-7f1, let-7i, MIR-007-1, MIR-015a, MIR-015b, MIR016-1, MIR-021, MIR-023a, MIR-024-1, 2, MIR-027a, b, MIR-030d, MIR-098, MIR-099a, MIR-100, MIR-125b-1, MIR-126, MIR-132, MIR-142-P, MIR-145-P, MIR-152, MIR-155, MIR181a, c, MIR-196a-2, MIR-212, MIR-213, MIR-218-1, 2, MIR-221, MIR-222-P, MIR301, MIR-331-P, MIR-345 y MIR376,

y en el que la combinación incluye una forma precursora o madura de MIR-021.

5. El método de la reivindicación 3, en el que el grupo de secuencias de miR consiste en let-7b; let-7d; let-7f-1; let-7i, MIR-015a; MIR-015b; MIR-016-1; MIR-021; MIR-023a, MIR-024, MIR-100; MIR-125b; MIR-132, MIR-155, MIR-181a, MIR-181c; MIR-196a-2, MIR-212; MIR-221; MIR-301 y MIR-376a, y en el que la combinación incluye una forma precursora o madura de MIR-021.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico de miR adicional en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que un aumento en el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR

correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático; y en el que el al menos un producto génico de miR adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: let-7a-2-P, let-7b, let-7c, let-7d, let-7f-1, let-7i, MIR-015b, MIR-019b-1-P, MIR-098, MIR-128a, MIR-135b, MIR-136, MIR-152, MIR-155, MIR-181a, MIR-196a-2, MIR-212, MIR215, MIR-218-1, MIR-218-2, MIR-301, MIR-328, MIR-331-P, MIR-424 o cualquier combinación de los mismos.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico de miR adicional en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que un aumento en el nivel del producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativo de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático; y en el que el al menos un producto génico de miR

adicional es MIR-155.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico de miR adicional en una muestra biológica procedente del páncreas del sujeto, en el que una disminución en el nivel de producto génico de miR en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto génico de miR 15 correspondiente en una muestra de control de tejido pancreático normal es indicativa de que el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, adenocarcinoma ductal pancreático; y en el que el al menos un producto génico de miR adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: MIR-139 (SEC ID Nº: 106) , MIR-337 (SEC ID Nº: 193) , MIR133b (SEC ID Nº: 97) , MIR-096-P (SEC ID Nº: 65) , MIR-371 (SEC ID Nº: 205) , MIR-383 (SEC ID Nº: 217) , MIR-092-2-P (SEC ID Nº: 62) , MIR-204 (SEC ID Nº: 155) , MIR-299-P (SEC ID Nº: 177) , MIR-375 (SEC ID Nº: 209) , MIR-188b

P (SEC ID Nº: 135) , y MIR-129-2 (SEC ID Nº: 91) o cualquier combinación de los mismos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el al menos un producto génico de miR adicional es MIR-096-P.

10. El método de la reivindicación 8, en el que el al menos un producto génico de miR adicional es MIR-375. 25

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que al menos un producto génico de miR cuyo nivel se mide es miARN maduro.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la muestra biológica comprende tejido 30 pancreático, tumor pancreático, células pancreáticas o jugo pancreático.

/ Femenino Cebadores de PCR usados para amplificar los precursores de miARN humanos, p. cebadores para la secuencia precursora primaria de miARN. Todos los demás cebadores hibiridan con horquillas presentes tanto en el precursor primario (pri-miARN) como en el precursor pre-miARN (pre-miARN) .