Péptido sintético derivado de Fasciola hepatica y su uso como vacuna.

Péptido sintético derivado de Fasciola hepática y su uso como vacuna.

La presente invención se refiere a polipéptidos o secuencias nucleotídicas que los codifican y composiciones que los contienen los cuales resultan útiles para la prevención y o el tratamiento de infecciones producidas por organismos del género Fasciola y más concretamente por Fasciola hepática. Estos elementos también resultan útiles para la producción de anticuerpos frente a dichos péptidos. Los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, composiciones, sueros y anticuerpos también resultan útiles para la elaboración de vacunas.

La presente invención se refiere a un polipéptido o una combinación de polipéptidos sintéticos derivados de secuencias de proteínas de Fasciola hepática, los cuales resultan útiles como vacuna frente a la infección producida por este organismo. La invención también se refiere a las secuencias nucleotídicas que codifican para los polipéptidos, y a composiciones que comprendan los polipéptidos. Además la presente invención también incluye los anticuerpos que reconocen los polipéptidos de la invención. Por tanto, la presente invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología y más concretamente dentro del campo de la biomedicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El organismo Fasciola hepática es un trematodo digénido que produce la enfermedad denominada fasciolosis o fascioliasis, la cual es transmitida principalmente por la ingestión de metacercarias adheridas a plantas acuáticas. Su distribución geográfica es cosmopolita y se han reportado casos de fasciolosis en los cinco continentes (Mas- Coma et al., 2009. Adv Parasitol. 69: 41-146; Hotez et al., 2012. PLoS Negl Trop Dis. 6: e1475).

Este organismo en su ciclo de vida necesita dos hospedadores, uno intermediario el cual es un caracol de agua dulce. En Europa el hospedador intermediario es el caracol Galba truncatula (sinónimo Lymnaea truncatula). El segundo hospedador o hospedador definitivo son principalmente mamíferos herbívoros como ovejas y vacas, pero también el ser humano (López-Abán et al., 2012. Manual de enfermedades importadas p.10).

A nivel veterinario, la fasciolosis causa grandes pérdidas económicas debidas principalmente a la muerte de los animales, disminución en la producción de carne y leche, así como el decomiso de los mismos por las autoridades sanitarias en los mataderos para evitar que puedan llegar al consumo alimentario humano (Rojo- Vázquez ef a/.,2012. Vet Parasitol. 1: 15-38).

Por otro lado, en humanos esta enfermedad está considerada como un problema de salud pública. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha descrito casos de fasciolosis humana en 51 países, con más de 17 millones de personas afectadas, existiendo mayores problemas de salud en áreas endémicas de países andinos, el área del Caribe, Norte de África, Europa del Este y cuenca del mar Caspio. En la actualidad se considera que existe un aumento en los casos registrados de fasciolosis humana ya que los avances surgidos en el diagnóstico de la enfermedad permiten detectar un mayor número de casos, considerándola una enfermedad emergente a nivel mundial (World Health Organization 2008. Facts sheet on fasciolasis. In action Against worms: 1-8).

Tras la ingestión de las metacercarias, los vermes juveniles liberados atraviesan la pared intestinal para migrar a través del parénquima hepático y llegar a su localización definitiva en los conductos biliares. El daño durante su proceso migratorio se debe a factores mecánicos como la abrasión que causan sus espículas o la succión originada por sus ventosas. Durante este proceso el parénquima hepático sufre una extensa destrucción con intensas lesiones y hemorragias causadas tanto por los vermes inmaduros como por la reacción inflamatoria e inmunológica desencadenada. Además se pueden producir infecciones bacterianas secundarias que pueden originar peritonitis. Los vermes adultos se localizan principalmente en los conductos biliares, pero pueden encontrarse en el conducto cístico, la vesícula biliar, la ampolla de Vater o el colédoco. Los conductos biliares interlobulares se observan dilatados y esclerosados, presentan hiperplasia y obstrucción del flujo biliar.

Las infecciones por este organismo se tratan fundamentalmente con triclabenzadol, un antihelmíntico seguro el cual actúa frente a las fasciolas tanto inmaduras como adultas y elimina hasta el 99% de las mismas. Sin embargo, no resulta útil en todos los casos y por tanto aun resulta necesaria la búsqueda de nuevos tratamientos. Además, debido al amplio uso de este fármaco en animales se han ido seleccionando organismos resistentes al mismo, por lo que su eficacia se ha ido viendo reducida paulatinamente (World Health Organization, 2006. Report of the WHO Informal Meeting on use of triclabendazole in fascioliasis control; Fairweather, 2009. J. Helminthol. 83: 139-150).

El control de la fasciolosis se basa principalmente en evitar la ingestión de plantas acuáticas (berros, marujas, lechugas, etc.) recogidas en zonas endémicas de fasciolosis y en efectuar tratamientos eficaces en ganado infectado con el parásito. Por último, se siguen realizando grandes esfuerzos para lograr una vacuna efectiva contra esta enfermedad. De esta manera se han descrito diferentes moléculas candidatas a vacunas (catepsinas, GST (Glutatión S-transferasa o "Glutathione S-transferase"), FABP (proteínas de unión a ácidos grasos o "fatty-acid-binding proteins"), etc.). (Hillyer, 2005. J. Helminthol. 79: 241-247; McManus et al., 2006. Parasitology. 133 Suppl: S43-61). Sin embargo en la actualidad no se dispone de una vacuna comercial eficaz.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos formados por al menos 3 repeticiones de una secuencia de aminoácidos. La presente invención también se refiere a combinaciones de los polipéptidos, así como a composiciones que comprenden dichos polipéptidos, solos o en combinación con otros elementos. También se refiere a anticuerpos producidos por la inmunización de un animal con cualquiera de estos elementos. La presente invención también se refiere al uso de estos polipéptidos, composiciones y/o anticuerpos para la elaboración de medicamentos, preferiblemente vacunas para la prevención de enfermedades producidas por organismos del género Fasciola y más concretamente por Fasciola hepatica.

En la presente invención, los inventores demuestran como el uso de uno de los polipéptidos denominados T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2) y T16 (SEQ ID NO: 3) o combinaciones de estos polipéptidos derivados de proteínas de Fasciola hepatica, provocan la generación de una respuesta inmune en el individuo. Además demuestran como mediante esta inmunización se disminuye la mortalidad de los individuos infectados con Fasciola hepatica, y se consigue una reducción en el daño hepático y del número de vermes presentes en el individuo. Estos polipéptidos son moléculas que presentan 3 copias de una secuencia de 15 aminoácidos. T14 se refiere a un péptido que presenta 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 17 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. T15 se refiere a un péptido que presenta 3

copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 18 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2. T16 se refiere a un péptido que presenta 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 19 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3. Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces. En una realización preferida el polipéptido comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite 3 veces. En una realización más preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 1. En otra realización más preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 18 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 18 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 2. En otra realización más preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 19 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 3. En una realización aun más preferida el polipéptido es el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida el polipéptido consiste en 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

Estos polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces, presentan una mayor utilidad que las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 en sí ya que inducen una respuesta inmunológica mayor y provocan una mayor protección.

En la presente invención los polipéptidos que presentan al menos 3 copias de un péptido pueden consistir únicamente en las secuencias de los péptidos repetidas en tándem de forma que no incluyen ningún aminoácido adicional, o bien pueden incluir aminoácidos adicionales entre las repeticiones separándolas y/o en los extremos, debido por ejemplo al método de obtención del péptido para permitir la fusión de monómeros mediante oxidación. Estos aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 18, donde dicha secuencia se repite al menos 3 veces.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 donde el número de repeticiones de SEQ ID NO: 18 es 3.

3. Polipéptido según la reivindicación 2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2.

4. Secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Construcción genética que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 4.

6. Construcción genética según la reivindicación 5 que es un vector de expresión.

7. Célula que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 4 o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.

8. Composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Composición según la reivindicación 8 que además comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 donde SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces o un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces.

10. Composición según la reivindicación 9 que comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 donde SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces y un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 donde el número de repeticiones de SEQ ID NO: 17 en el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 es 3, y/o el número de repeticiones de SEQ ID NO: 19 en el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 es 3.

12. Composición según la reivindicación 11 donde el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 es el polipéptido SEQ ID NO: 2 y/o donde el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 es el polipéptido SEQ ID NO: 3.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que además comprende un inmunomodulador, un aceite no-mineral y/o un adyuvante.

14. Composición según la reivindicación 14 donde el inmunomodulador es AA0029.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde el adyuvante es al menos una saponina de Quillaja saponaria.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde el adyuvante es Qs21.

17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 donde el aceite no- mineral es Montanide ISA 763A.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17 que además comprende otro péptido derivado de Fasciola hepatica.

19. Composición según la reivindicación 18 donde el péptido derivado de Fasciola hepatica es un polipéptido que comprende al menos tres copias de uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 4-16 o SEQ ID NO: 20-27.

20. Composición según la reivindicación 19 donde el polipéptido es uno de los polipéptidos de secuencia SEQ ID NO: 28-48

21. Anticuerpos aislados producidos tras la inmunización de un mamífero con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20.

22. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una

secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, una célula según la reivindicación 7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 o un anticuerpo según la reivindicación 21 para la elaboración de un medicamento.

23. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, una célula según la reivindicación 7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 o un anticuerpo

según la reivindicación 21 para la prevención y/o el tratamiento de infecciones producidas por organismos del género Fasciola.

24. Uso según la reivindicación 23 donde el organismo del género Fasciola es de la especie Fasciola hepática.

25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 donde el medicamento es una vacuna.