Películas de polipéptidos y métodos.

Un método para preparar una película, comprendiendo el método bien:

a) depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y

depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa;

en donde (i) el polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, se deposita sobre elsustrato en presencia de un precipitante polimérico;

(ii) el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta; y

(iii) el polipéptido de primera capa, el polipéptido de segunda capa, o ambos, se deposita en presencia de unamolécula bioactiva y/o el sustrato comprende una molécula bioactiva;

o bien

b) depositar una molécula bioactiva sobre la superficie de un sustrato en presencia de un precipitante polimérico;

depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie del sustrato para formar una primera capa; y

depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa;en donde el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridadopuesta.

Películas de polipéptidos y métodos

Campo técnico

La presente invención se refiere a la fabricación de películas y microcápsulas de polipéptidos producidas por nanoingeniería, y a métodos para preparar y usar tales películas y microcápsulas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la encapsulación de biomacromoléculas funcionales en microcápsulas de polipéptidos producidas por nanoingeniería.

Antecedentes de la invención Las películas multicapas de polielectrolitos son películas finas (p.ej., de unos nanómetros a milímetros de grosor) compuestas de capas alternantes de polielectrolitos cargados opuestamente. Tales películas pueden ser formadas por ensamblaje capa a capa sobre un sustrato adecuado. En el autoensamblaje electrostático capa a capa (“ELBL”, por sus siglas en inglés) , la base física de asociación de polielectrolitos es la electrostática. La construcción de películas es posible porque el signo de la densidad de carga superficial de la película se invierte con la deposición de capas sucesivas. El principio general de la deposición ELBL de poliiones cargados opuestamente se ilustra en la Figura 1. La generalidad y simplicidad relativa del procedimiento ELBL permite la deposición de muchos tipos diferentes de polielectrolitos sobre muchos tipos diferentes de superficie. Las películas multicapas de polipéptidos son un subconjunto de películas multicapas de polielectrolitos, que comprenden al menos una capa que comprende un polipéptido cargado. Una ventaja clave de las películas multicapas de polipéptidos es su benignidad medioambiental. Las películas ELBL también se pueden usar para encapsulación. Las aplicaciones de las películas de polipéptidos y microcápsulas incluyen, por ejemplo, nano-reactores, biosensores, células artificiales y vehículos de entrega de fármacos.

Los principios de diseño para la incorporación de polipéptidos en películas multicapas fueron elucidados por primera vez en la publicación de patente de EE.UU. Nº 20050069950. Brevemente, la idoneidad de un polipéptido para ELBL está relacionada con la carga neta sobre el polipéptido y la longitud del polipéptido. Un polipéptido adecuado para ELBL comprende preferiblemente uno o más motivos de secuencia de aminoácidos, esto es, secuencias de aminoácidos contiguos que tienen una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos y que tienen una densidad de carga lineal adecuada para la deposición electrostática. Un polipéptido para ELBL se puede diseñar de diferentes maneras, por ejemplo, uniendo una pluralidad de motivos de secuencias de aminoácidos unos a otros, bien directamente o bien mediante un enlazante. Se pueden depositar fácilmente polipéptidos que tienen la longitud y propiedades de carga apropiadas para formar una o más capas de una película multicapas de polipéptido.

Las proteínas, péptidos y oligonucleótidos pueden ser potentes agentes terapéuticos. Tales biomoléculas, sin embargo, son dianas de diversos mecanismos de degradación in vivo. La encapsulación de biomoléculas y otras moléculas bioactivas dentro de un microentorno biocompatible, para la preservación extendida de la función o la liberación controlada, es una estrategia para mejorar la disponibilidad de las moléculas bioactivas en sitios fijados como diana. La deposición de una película de polipéptido sobre un sustrato revestido con una biomolécula podría extender de manera similar la preservación de la función o la liberación controlada de la biomolécula. El nanoensamblaje electrostático capa a capa es un medio para preparar películas multicapas y microcápsulas de polielectrolitos de alta estabilidad y permeabilidad mejorable.

Sigue habiendo una necesidad de medios alternativos para conseguir una retención directa y eficaz de macromoléculas bioactivas funcionales, por ejemplo una proteína, en películas y microcápsulas de polipéptidos biodegradables producidas por ingeniería.

Compendio de la invención Se describe en la presente memoria un método para preparar una película que comprende depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa. El polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, se deposita sobre el sustrato en presencia de un precipitante polimérico; y el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta. También se describe que el polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, comprende un homopolipéptido de lisina, ácido glutámico, y otro tipo de aminoácido que tenga una cadena lateral cargada a pH neutro. Adicionalmente, se describe que el polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, comprende un polipéptido diseñado, en donde el polipéptido diseñado comprende uno o más primeros motivos de secuencia de aminoácidos, en donde el uno o más primeros motivos de secuencia de aminoácidos consiste en 5 a 15 residuos de aminoácidos y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor que o igual a 0, 4, y en donde el polipéptido diseñado no es un homopolipéptido, es al menos de 15 residuos de aminoácidos de largo, y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor que o igual a 0, 4.

Se describe un método para mejorar la retención de moléculas bioactivas durante la fabricación de una película multicapas de polielectrolitos, que comprende depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa. El polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, se deposita sobre el sustrato en presencia de un precipitante polimérico; el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta; y el sustrato comprende una molécula bioactiva.

Así, la presente invención proporciona un método para preparar una película, comprendiendo el método bien:

a) depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa;

en donde (i) el polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, se deposita sobre el sustrato en presencia de un precipitante polimérico;

(ii) el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta; y

(iii) el polipéptido de primera capa, el polipéptido de segunda capa, o ambos, se deposita en presencia de una molécula bioactiva y/o el sustrato comprende una molécula bioactiva;

o bien b) depositar una molécula bioactiva sobre la superficie de un sustrato en presencia de un precipitante polimérico; depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie del sustrato para formar una primera capa; y

depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa;

en donde el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta. Los rasgos descritos anteriormente y otros se ilustran mediante las siguientes figuras y descripción detallada.

Dibujos Haciendo referencia ahora a las figuras, que son realizaciones ilustrativas:

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del ensamblaje de polipéptidos cargados opuestamente.

La Figura 2 muestra la capacidad de adsorción de glucosa oxidasa (GOx) sobre plantillas de partículas de CaCO3 o melamina formaldehído (MF) en función de la concentración de la enzima y la concentración de NaCl.

La Figura 3 muestra la pérdida de GOx adsorbida de plantillas de CaCO3 durante la deposición de una película encapsulante de poli (L-lisina) /poli (ácido L-glutámico) (PLL/PLGA) como absorbancia a 280 nm debida a la GOx liberada presente en el lavado, tampón de de ensamblaje de poli (L-lisina) (PLL) , o tampón de ensamblaje de poli (ácido L-glutámico) (PLGA) en ausencia de un precipitante polimérico, en presencia de PEG 300 al 40%, o en presencia de PEG 300 al 50%.

La Figura 4 muestra la retención de GOx sobre plantillas de CaCO3 durante la deposición de una película encapsulante de (PLL) / (PLGA) en presencia o ausencia de PEG 300 al 50% en las disoluciones de deposición.

La Figura 5 muestra el esquema de reacción... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una película, comprendiendo el método bien:

a) depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa;

en donde (i) el polielectrolito de primera capa, el polielectrolito de segunda capa, o ambos, se deposita sobre el sustrato en presencia de un precipitante polimérico;

(ii) el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta; y

(iii) el polipéptido de primera capa, el polipéptido de segunda capa, o ambos, se deposita en presencia de una molécula bioactiva y/o el sustrato comprende una molécula bioactiva;

o bien b) depositar una molécula bioactiva sobre la superficie de un sustrato en presencia de un precipitante polimérico; depositar un polielectrolito de primera capa sobre una superficie del sustrato para formar una primera capa; y

depositar un polielectrolito de segunda capa sobre el polielectrolito de primera capa para formar una segunda capa; en donde el polielectrolito de primera capa y el polielectrolito de segunda capa tienen cargas netas de polaridad opuesta.

2. El método de la reivindicación 1a, en donde la molécula bioactiva está en la forma de un revestimiento sobre el sustrato, o está en la forma de un núcleo.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el sustrato comprende una plantilla adecuada para desintegración después de la deposición de la película multicapas de polielectrolito.

4. El método de la reivindicación 1a, en donde el polielectrolito de la primera capa, el polielectrolito de la segunda capa, o ambos, comprende un polipéptido diseñado, en donde el polipéptido diseñado comprende uno o más primeros motivos de secuencia de aminoácidos, en donde el uno o más motivos de secuencia de aminoácidos consiste en 5 a 15 residuos de aminoácidos y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor que o igual a 0, 4, y

en donde el polipéptido diseñado no es un homopolipéptido, es al menos de 15 residuos de aminoácidos de largo, y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor que o igual a 0, 4.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1a o 2 a 4, que comprende además depositar una molécula bioactiva sobre la superficie del sustrato antes de depositar el polielectrolito de primera capa.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1a o 2 a 5, en donde el precipitante polimérico comprende polietilenglicol, poli (ácido acrílico) , poli (alcohol vinílico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (propilenglicol) , o una combinación de uno o más de los precipitantes poliméricos anteriores.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1a o 2 a 6, en donde la película está en la forma de una microcápsula.

8. El método de la reivindicación 7, en donde una molécula bioactiva es encapsulada por la microcápsula.

9. El método de la reivindicación 1b, en donde la primera capa de polielectrolito, la segunda capa de polielectrolito, o ambas, es depositada sobre el sustrato en presencia de un precipitante polimérico.