Obtención de acetona por fermentación a partir de materias primas renovables mediante una nueva ruta metabólica.

Procedimiento para la preparación de acetona partiendo de la acetil-Coenzima A,

que comprende las etapas de:

A. una reacción enzimática de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA catalizada por una β-cetotiolasa

B. una reacción enzimática de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y CoA catalizada por una acetoacetato- CoA hidrolasa, una acil-CoA-tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA-tiocinasa

C. una descarboxilación de acetoacetato para dar acetona y CO2, catalizada por una acetoacetato descarboxilasa

caracterizado por que

en la etapa B de procedimiento, la coenzima A no es transferida a una molécula aceptora, y

la reacción enzimática en la etapa B de procedimiento es catalizada por un polipéptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, 3 ó 5.

Obtenciïn de acetona por fermentaciïn a partir de materias primas renovables mediante una nueva ruta metabïlica Sector del invento Son objeto del invento una nueva ruta de biosïntesis enzimïtica para la producciïn de acetona, la cual, al contrario que los procedimientos de fermentaciïn habituales, estï desacoplada de la formaciïn de etanol y butanol, asï como las enzimas y los ïcidos nucleicos que se utilizan en estos casos.

Estado de la tïcnica Proceso ABE en Clostridium

El clïsico proceso de fermentaciïn ABE, es decir, la producciïn microbiana de acetona, butanol y etanol, fue el segundo proceso biotecnolïgico mïs grande a escala mundial durante un prolongado perïodo de tiempo, directamente despuïs de la fermentaciïn de etanol con levaduras. La fermentaciïn ABE comercial se iniciï en 1916 en Inglaterra, en donde, entre otros, Chaim Weizmann descubriï la capacidad de Clostridium acetobutylicum para la formaciïn de los disolventes acetona, butanol y etanol. El proceso fue utilizado hasta finales de los aïos 50 en el mundo occidental, y en Surïfrica incluso todavïa hasta 1981.

Dos motivos principales son responsables de que este proceso fuese desechado: por una parte, la sïntesis quïmica de acetona y butanol se hizo cada vez mïs barata, y, por otra parte, el precio de los substratos de la fermentaciïn aumentï grandemente. Especialmente el precio de las melazas aumentï grandemente debido a su utilizaciïn como aditivo para piensos de animales bovinos.

Los costes crecientes de los productos precursores petroquïmicos, asï como tambiïn las nuevas posibilidades tecnolïgicas dentro del sector de la ingenierïa de la ruta metabïlica (en inglïs "pathway engineering) de los microorganismos han abierto por fin nuevas opciones para el desarrollo de cepas de alto rendimiento y de procesos comerciales de fermentaciïn para la producciïn de disolventes tales como la acetona.

La clïsica fermentaciïn ABE se basa en los organismos Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii. Ambos son gram positivos y se reproducen en condiciones estrictamente anaerobias. Estos organismos pueden convertir quïmicamente a mono-, di-y polisacïridos, siendo las melazas y los almidones los substratos utilizados predominantemente en la fermentaciïn.

El proceso de fermentaciïn con C. acetobutylicum se subdivide en dos fases. En la primera fase, la formaciïn de biomasa va acompaïada por la formaciïn de acetato, butirato y de trazas de etanol ("fase acidogïnica") . En la segunda fase, la denominada "fase solventogïnica", los ïcidos son aprovechados entonces para formar los productos de fermentaciïn acetona, butanol y etanol (ABE) . Los productos acetona, butanol y etanol se forman en el

C. acetobutylicum del tipo silvestre en la relaciïn de aproximadamente 3 : 6 : 1. Esta relaciïn de productos puede variar en gran manera segïn sean las condiciones de cultivo escogidas (p.ej. el pH o la aportaciïn de sustancias nutrientes) o los substratos empleados.

Las enzimas de la biosïntesis de los disolventes acetona, butanol y etanol estïn ampliamente purificadas y caracterizadas bioquïmicamente (compïrese la Figura 1; Duerre, P., y Bahl, H. 1996. Microbial production of acetone/butanol/isopropanol (Producciïn microbiana de acetona/butanol/isopropanol) . En: Biotechnology, tomo 6, 2a ediciïn M. Roehr (compilador de ediciïn) , VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, Alemania. p. 229-268. Duerre,

P. 1998. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation (Nuevos conocimientos y recientes desarrollos en la fermentaciïn clostridiana de acetona/butanol/isopropanol) . Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639-648.) . Tambiïn se encuentra presente la secuencia genïmica de C. acetobutylicum (Noelling, J., Breton, G., Omelchenko, M. V. y otros 16 autores (2001) . Genome sequence and comparative analysis of the solvent producing bacterium Clostridium acetobutylicum (Secuencia genïmica y anïlisis comparativo de la bacteria productora de disolventes Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol 183, 4823-4838.) .

En los ïltimos aïos se desarrollï una serie de herramientas genïticas, que hacen posible un deliberado tratamiento ingenieril de la ruta metabïlica. Hasta ahora, estïn a disposiciïn tres replicones diferentes, que se conservan de una manera estable (pIM13, pCBU2 y pAMï1; Lee y colaboradores (1992) . Vector construction, transformation, and gene amplification in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Construcciïn de vectores, transformaciïn y amplificaciïn gïnica en Clostridium acetobutylicum ATCC 824) . Ann. N. Y. Acad. Sci. 665: 39-51; Minton y colaboradores 1993) . Clostridial cloning vectors (Vectores de clonaciïn clostridiana) . En: The clostridia and biotechnology (Las clostridias y su biotecnologïa) (D. R. Woods; compilador de ediciïn) . Butterworth-Heinemann. Stoneham, EE.UU. P. 119-150) y dos marcadores de resistencia a antibiïticos frente a eritromicina y tiamfenicol (Green y Bennett (1998) . Genetic manipulation of acid and solvent formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. (Manipulaciïn genïtica de la formaciïn de ïcidos y disolventes en Clostridium acetobutylicum ATCC 824) . Biotechnol. Bioeng. 58: 215-21.) .

Por el contrario, ciertos mïtodos tales como la desactivaciïn por inserciïn o las supresiones (deleciones) de genes todavïa no son realizables de una manera rutinaria, y tambiïn la inhibiciïn de la expresiïn gïnica basada en una orientaciïn antisentido varïa en cuanto a la efectividad en este conjunto de organismos y nunca es completa (Desai y Papoutsakis (1999) . Antisense RNA strategies for metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum (Estrategias con ARN antisentido para la ingenierïa metabïlica de Clostridium acetobutylicum) . Appl. Environ. Microbiol. 65:93645; Tummala y colaboradores (2003) . Antisense RNA downregulation of coenzyme A transferase combined with alcohol-aldehy de dehydrogenase overexpression leads to predominantly alcohologenic Clostridium acetobutylicum fermentations (Una regulaciïn en sentido descendente con un ARN antisentido de la coenzima A transferasa, combinada con una sobreexpresiïn de la alcohol-aldehïdo deshidrogenasa, conduce a unas fermentaciones predominantemente alcohologïnicas de Clostridium acetobutylicum) . J. Bacteriol. 185:3644-53) . Una serie de publicaciones describe la ingenierïa de la ruta metabïlica de biosïntesis tanto "solventogïnica" como tambiïn "acidogïnica". La desactivaciïn de los genes buk (de la butirato cinasa) o pta (de la fosfotransacetilasa) condujo a unas disminuciones drïsticas de las concentraciones de butirato o respectivamente de acetato (Green y colaboradores (1996) ; Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Manipulaciïn genïtica de la rutas metabïlicas de formaciïn de ïcidos mediante desactivaciïn de genes en Clostridium acetobutylicum ATCC 824) . Microbiology. 142:2079-86; Harris y colaboradores (2000) . Characterization of recombinant strains of the Clostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant: need for new phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition? (Caracterizaciïn de cepas recombinantes del mutante con desactivaciïn de la butirato cinasa de Clostridium acetobutylicum: ïExiste una necesidad de nuevos modelos fenomenolïgicos para la solventogïnesis y la inhibiciïn de butanol Biotechnol. Bioeng. 67:1-11) . A pesar de ello, por estos mutantes se formaban butirato y acetato, puesto que las enzimas acetato cinasa y fosfotransbutirilasa sustituïan a las enzimas desactivadas butirato cinasa y fosfotransacetilasa. Ambas cepas formaban altas concentraciones de ïcido lïctico, el cual no se enriquece por el C. acetobutylicum del tipo silvestre, posiblemente como una reacciïn al enriquecimiento del piruvato. La desactivaciïn de la aldehïdo/alcohol-deshidrogenasa adhE/aad conducïa a un drïstico hundimiento de la formaciïn de butanol y a un simultïneo aumento de las concentraciones de butirato. Sin embargo, las concentraciones de butirato y butanol que son usuales en el tipo silvestre se ajustan de nuevo cuando el gen adhE/aad es expresado sobre un plïsmido en este mutante. De modo interesante, ni en el mutante de AdhE/aad ni en la cepa con la complementaciïn con adhE/aad se pudo detectar una formaciïn de acetona. Este fenïmeno se basa en unos efectos polares, que repercuten sobre dos genes localizados corriente abajo (“downstream”) del adhE/aad. Estos dos genes codifican las dos subunidades de la coenzima A transferasa, que es esencial para la biosïntesis de acetona (Green, E.M, y Bennett, G.N. 1996. Inactivation of an aldehy de/ alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Desactivaciïn... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparaciïn de acetona partiendo de la acetil-Coenzima A, que comprende las etapas de:

A. una reacciïn enzimïtica de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA catalizada por una β-cetotiolasa B. una reacciïn enzimïtica de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y CoA catalizada por una acetoacetato-CoA hidrolasa, una acil-CoA-tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA-tiocinasa C. una descarboxilaciïn de acetoacetato para dar acetona y CO2, catalizada por una acetoacetato descarboxilasa caracterizado por que en la etapa B de procedimiento, la coenzima A no es transferida a una molïcula aceptora, y la reacciïn enzimïtica en la etapa B de procedimiento es catalizada por un polipïptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de aminoïcidos, que es idïntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoïcidos SEQ ID No. 1, 3 ï 5.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que la reacciïn enzimïtica en la etapa A de procedimiento es catalizada por un polipïptido con una actividad de cetotiolasa y con una secuencia de aminoïcidos, que es idïntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoïcidos SEQ ID No. 16.

3. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la reacciïn enzimïtica en la etapa C de procedimiento es catalizada por un polipïptido con una actividad de acetoacetato descarboxilasa y con una secuencia de aminoïcidos, que es idïntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoïcidos SEQ ID No. 18.

4. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado por que la reacciïn en la etapa C de procedimiento se efectïa espontïneamente.

5. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado por que es llevado a cabo por medio de un microorganismo.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 5, caracterizado por que el microorganismo contiene por lo menos: a un ïcido nucleico que codifica proteicamente por lo menos un polipïptido de acuerdo con la reivindicaciïn 2

y

b un ïcido nucleico que codifica proteicamente el polipïptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de aminoïcidos, que es idïntica en por lo menos un 90 % a la SEQ ID No. 1, 3 ï 5, y

c un ïcido nucleico que codifica proteicamente por lo menos un polipïptido de acuerdo con la reivindicaciïn 3 siendo utilizados los ïcidos nucleicos a, b y c para asegurar la expresiïn del polipïptido en el microorganismo.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 6, caracterizado por que el ïcido nucleico a se escoge entre: aa una secuencia de ADN descrita por la secuencia 17 o por su cadena complementaria, bb unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

descritas dentro de aa cc unas secuencias de ADN, que sin la degradaciïn del cïdigo genïtico se hibridarïan para dar las secuencias de ADN definidas en aa y bb.

8. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado por que el ïcido nucleico c se escoge entre: dd una secuencia de ADN descrita por la secuencia 19 o por su cadena complementaria, ee unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

descritas dentro de dd ff unas secuencias de ADN, que sin la degradaciïn del cïdigo genïtico se hibridarïan para dar las secuencias de ADN descritas dentro de dd y ee.

9. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ïcido nucleico b se escoge entre: gg una secuencia de ADN descrita por la secuencia 2 o por su cadena complementaria, hh unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

descritas dentro de gg unas secuencias de ADN, que sin la degradaciïn del cïdigo genïtico se hibridarïan para dar las secuencias de ADN descritas dentro de gg y hh.

10. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ïcido nucleico b se escoge entre: jj una secuencia de ADN descrita por la secuencia 4 o por su cadena complementaria, kk unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

descritas dentro de jj ll unas secuencias de ADN, que sin la degradaciïn del cïdigo genïtico se hibridarïan para dar las secuencias de ADN descritas dentro de jj y kk.

11. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ïcido nucleico b se escoge entre: mm una secuencia de ADN descrita por la secuencia 6 o por su cadena complementaria, nn unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

descritas dentro de mm oo unas secuencias de ADN, que sin la degradaciïn del cïdigo genïtico se hibridarïan para dar las secuencias de ADN descritas dentro de mm y nn.

12. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 11, estando situados los ïcidos nucleicos a, b y c en una cadena de nucleïtidos, y ïsta se escoge entre el conjunto formado por:

el plïsmido pSKatt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el plïsmido pKSatt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el plïsmido pUC19att, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el plïsmido pUC18att, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No.10,

y el plïsmido pUC19ayt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.

13. ïcido nucleico escogido entre el conjunto formado por: el plïsmido pSKatt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el plïsmido pKSatt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el plïsmido pUC19att, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el plïsmido pUC18att, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No.10,

y el plïsmido pUC19ayt, con la secuencia de ïcido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.

Figura 1

Figura 9

Figura 11