Nuevos sustratos enzimáticos de nitrorreductasa.

Utilización de un compuesto de la fórmula (I) siguiente, como sustrato enzimático para la detección de una actividad nitrorreductasa:

**Fórmula**



según la cual:

* W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos

* n ≥ 0, 1 o 2

* X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y z6 un alquilo

* Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

* siendo Z1, Z2, Z3 y Z4, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo

y sus sales.

Nuevos sustratos enzimáticos de nitrorreductasa La presente invención se refiere a nuevos sustratos enzimáticos para la detección de actividad nitrorreductasa. Estos sustratos son utilizables en las aplicaciones que comprenden una etapa de reducción enzimática que produce una señal fisicoquímica, en particular en microbiología, bioquímica, inmunología, biología molecular, histología, etc.

Existen actualmente muy numerosos medios que permiten la detección de microorganismos. Esta detección se puede basar en particular en la utilización de sustratos particulares, específicos de una enzima del microorganismo que se desea detectar. De manera general, los sustratos sintéticos de enzimas están constituidos de tal manera que el sustrato y el producto de su metabolismo por la enzima diana poseen unas propiedades fisicoquímicas diferentes, que permiten distinguirlos y evaluarlos si todo o parte del sustrato se ha convertido en producto por la enzima. Por ejemplo, el producto del metabolismo enzimático puede ser cromógeno o fluorescente. Así, en el caso de las bacterias mediante la selección de los sustratos, según haya reacción o no, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo. Se puede particularmente utilizar una actividad nitrorreductasa para revelar un grupo, un género o una especie de bacterias. Puede asimismo ser utilizado para seguir el metabolismo reductor de microorganismos, por ejemplo unido a su crecimiento o a la inhibición de este crecimiento.

La capacidad de ciertas bacterias para reducir los compuestos nitro-aromáticos se conoce desde hace numerosos años. Asnis (1957) ha detallado el aislamiento de una flavoproteína a partir de extractos de E. coli que era capaz de reducir el ácido p-nitrobenzoico. A partir de este informe, la actividad nitroaril-reductasa se identificó en diversas variedades de organismos. Esto incluye los aerobios estrictos tales como Pseudomonas spp. (Won et al. 1974) y Nocardia spp. (Villanueva 1964) , los anaerobios estrictos tales como Clostridium spp. (Ancermaier & Simon 1983) y Veillonella spp. (McCormick et al. 1976) , o también los hongos (Masuda & Ozaki 1993) y los parásitos eucarióticos (Douch 1975) . Existe una gama de sustratos que se consideran como susceptibles de ser reducidos por las nitroarilreductasas bacterianas. Se trata sobretodo de compuestos nitroaromáticos tales como el ácido p-nitrobenzoico, el pnitrofenol, la p-nitroanilina y el 2, 4, 6-trinitrotolueno (McCormick et al. 1976) .

De manera general, la detección de la actividad enzimática nitrorreductasa se realiza mediante unos métodos indirectos tales como el seguimiento de la desaparición del sustrato o de un cofactor. Por ejemplo, Kitamura et al. (1983) han estudiado la reducción del metil p-nitrobenzoato y de una gama de otros compuestos aromáticos nitrados con unos extractos de E. coli. Sin embargo, este método es poco sensible y no es adecuado para una detección en medio heterogéneo. Se puede citar también la solicitud WO 00/28073 que describe un sustrato fluorógeno a base de nitrocoumarina para la detección directa de las actividades nitroaril-reductasa. Este tipo de compuesto nitroaromático es capaz de producir, después de la reducción, un compuesto muy fluorescente que es por lo tanto fácilmente detectable. Sin embargo, este sustrato no es muy adecuado para una detección en medio heterogéneo. Otros sustratos enzimáticos de nitrorreductasa son descritos en la solicitud de patente FR2916762.

La presente invención propone por lo tanto mejorar los sustratos de nitrorreductasa que permitan la detección de microorganismos. Comparativamente a los sustratos existentes, estos nuevos sustratos son de síntesis fácil, y pueden ser utilizados en particular en medios gelificados para la detección de microorganismos ya que producen una coloración que no se difunde en el medio de reacción.

Además, la presente invención contribuye a mejorar el estado de la técnica por que los compuestos según la invención permiten la detección de microorganismos que presentan conjuntamente una actividad nitrorreductasa y un metabolismo que conlleva una variación de pH del medio.

Antes de avanzar en la descripción de la invención, se dan a continuación las definiciones a fin de facilitar la descripción de la invención.

Por sustrato enzimático, se entiende un sustrato que puede ser modificado por una enzima en un producto que permite la detección, directa o indirecta, de un microorganismo, de una célula o de un orgánulo. En el caso de los sustratos de nitrorreductasa, este sustrato comprende en particular una función nitrato que está parcial o totalmente reducida por la actividad enzimática a ser revelada, modificando la reducción de esta función nitrato algunas propiedades fisicoquímicas de la molécula, permitiendo supervisar esta reducción.

Los sustratos según la invención son adecuados para una utilización en citometría de flujo, ya que, al permanecer el producto de la reducción principalmente localizado en la célula que expresa la actividad enzimática, es posible calcular específicamente las células que expresan esta actividad, incluso separarlas del resto de la muestra.

Los sustratos según la invención son también muy adecuados para una utilización en histoenzimología, ya que al permanecer el producto de reducción principalmente localizado en el medio de la reducción, es posible identificar específicamente las células u orgánulos que expresan esta actividad dentro de un tejido.

Debido a su baja toxicidad, los sustratos según la invención son muy adecuados para el seguimiento de actividad nitrorreductasa en cultivo celular.

Los sustratos según la invención son particularmente muy adecuados para una utilización en el medio de detección y/o de identificación, ya que producen una coloración o una fluorescencia que no se difunde en el medio de reacción. En la presente solicitud, el término coloración se utiliza para cubrir una coloración en el espectro visible, absorción de luz, o una fluorescencia, absorción a una longitud de onda (λex) y emisión a una longitud de onda superior (λem, λem > λex) .

Los sustratos de la invención pueden ser salificados, es decir en forma de sal tal como cloruro, bromuro, yoduro potasio o trifluoroacetato.

Por indicador de pH, se entiende una sustancia química cuyo color y/o fluorescencia varía en función de las modificaciones de pH del medio, estando dichas modificaciones relacionadas o no con el metabolismo del o de los microorganismos en crecimiento sobre dicho medio.

Por nitrorreductasa, se entiende una enzima que puede reducir total o parcialmente un grupo NO2.

Por grupo alquilo, se entiende una cadena de grupos hidrocarbonados saturados, tales como en particular un alquilo de C1-C6, es decir un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. A título de ejemplo, se puede citar el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el butilo, el t-butilo, el pentilo, el iso-pentilo y el hexilo.

Por grupo arilo, se entiende un grupo funcional (o sustituyente) que deriva de un núcleo aromático tal como un núcleo aromático de C6-C10, en particular fenilo, bencilo, 1-naftilo o 2-naftilo.

Por grupo carboxilo, se entiende en particular un grupo funcional compuesto de un átomo de carbono, unido por un doble enlace a un primer átomo de oxígeno, y por un enlace simple a un segundo átomo de oxígeno, él mismo cargado negativamente o unido a un átomo de hidrógeno. En función del pKa de la molécula y del pH del medio, el grupo carboxilo puede estar en forma ionizada, es decir sin H unido al segundo átomo de oxígeno, que está entonces cargado negativamente.

Por medio de reacción, se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de un metabolismo y/o para el crecimiento de microorganismos, de una célula o de un orgánulo. Este medio de reacción puede ser utilizado en citometría de flujo, histoenzimología, cultivo celular, etc. o como medio de detección y/o de identificación de microorganismos.

El medio de reacción puede ser sólido, semi-sólido o líquido. Por medio sólido, se entiende por ejemplo un medio gelificado. El agar es el agente gelificante tradicional en microbiología para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar gelatina o agarosa. Están disponibles en el comercio un cierto número de preparaciones, como por ejemplo el agar Columbia, la gelosa tripcasa-soja, la gelosa Mac Conkey, la gelosa Sabouraud o más generalmente las descritas en el Handbook of Microbiological Media (CRC Press) .

El medio de reacción puede comprender uno o varios elementos en combinación, tales como unos aminoácidos,... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un compuesto de la fórmula (I) siguiente, como sustrato enzimático para la detección de una actividad nitrorreductasa:

** (Ver fórmula) **

según la cual: 10

â?¢ W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos

â?¢ n = 0, 1 o 2 15

â?¢ X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y z6 un alquilo

â?¢ Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico 20

â?¢ siendo Z1, Z2, Z3 y Z4, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo y sus sales. 25

2. Utilización de un compuesto de la fórmula (I) siguiente, como sustrato enzimático para la detección de una actividad nitrorreductasa y un indicador de una variación de pH:

** (Ver fórmula) **

según la cual:

â?¢ W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos 35

â?¢ n = 0, 1 o 2

â?¢ X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y Z6 un

alquilo 40

â?¢ Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

â?¢ siendo Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 y Z6, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo

y sus sales.

3. Utilización de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 o 2, según la cual n = 1

4. Utilización de un compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones anteriores, según la cual W1, W2, W3 y W4 son independientemente H.

5. Utilización de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, según la cual X es S o CZ5Z6, preferiblemente CCH3CH3. 15

6. Utilización de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, según la cual Y es N o N+CH3.

7. Utilización de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores según la cual Z1, 20 Z2, Z3y Z4, son H.

8. Utilización de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 o 2, según la cual dicho compuesto se selecciona entre 2- (4'-Nitroestiril) -benzotiazol, cloruro de 2- (4'-nitroestiril) -N-metil-benzotiazolio, dibromuro de 2- (4'nitroestiril) -1, 3, 3-trimetil-indolinio.

9. Procedimiento para la detección en microorganismos de una actividad nitrorreductasa, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a) Disponer en un medio de detección y/o de identificación que comprende un compuesto de la fórmula (I) 30

** (Ver fórmula) **

según la cual:

â?¢ W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos â?¢ n = 0, 1 o 2

â?¢ X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y Z6 un alquilo â?¢ Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico 45 â?¢ siendo Z1, Z2, Z3 y Z4, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo y sus sales;

b) inocular el medio con una muestra biológica a ensayar, c) dejar incubar, y

d) revelar la presencia de al menos una actividad nitrorreductasa.

10. Procedimiento para la detección de una actividad nitrorreductasa en microorganismos y de una variación de pH, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a) Disponer en un medio de detección y/o de identificación que comprende un compuesto de la fórmula (I)

** (Ver fórmula) **

según la cual:

â?¢ W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos â?¢ n = 0, 1 o 2

â?¢ X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y Z6 un alquilo â?¢ Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico â?¢ siendo Z1, Z2, Z3 y Z4, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo y sus sales;

b) inocular el medio con una muestra biológica a ensayar, c) dejar incubar, y d) observar un cambio de color y/o de fluorescencia del medio de detección y/o de identificación, que revela la presencia de al menos una actividad nitrorreductasa, y una variación de pH en dicho medio.

11. Medio de detección y/o de identificación de microorganismos que comprende un compuesto de fórmula (I) 35 siguiente:

** (Ver fórmula) **

según la cual:

â?¢ W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos

â?¢ n = 0, 1 o 2 5

â?¢ X es NR, CZ5Z6, S u O, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico, siendo Z5 y Z6 un alquilo

â?¢ Y es N o N+R, siendo R alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico 10

â?¢ siendo Z1, Z2, Z3 y Z4, independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo y sus sales 15

12. Medio de detección y/o de identificación de microorganismos según la reivindicación 11, que comprende además al menos un compuesto cuyo metabolismo conlleva una variación de pH de dicho medio, siendo dicho compuesto un azúcar, un aminoácido o un ácido orgánico.