Nuevos sustratos de peptidasa.

Utilización de un compuesto de la fórmula (I) siguiente, como sustrato enzimático para la detección de una actividad peptidasa y/o una variación de pH:

**Fórmula**

según la cual:

* Y1 es un péptido, H o un alquilo

* W1, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos

* n ≥ 0, 1 o 2

* U y V son N, N+R, CZ4, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

* siendo Z1, Z2, Z3 y Z4 independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo y sus sales.

Nuevos sustratos de peptidasa

La presente invención se refiere a nuevos compuestos utilizables a título de indicadores de pH y/o de sustratos enzimáticos para la detección de actividad peptidasa. Estos sustratos son utilizables en las aplicaciones que comprenden una etapa de hidrólisis enzimática que produce una señal fisicoquímica, en particular en microbiología, bioquímica, inmunología, biología molecular, histología, etc. La invención se refiere también a medios de reacción que contienen tales sustratos, a la utilización de los sustratos o de los medios para la detección de actividades peptidasas y/o la diferenciación de bacterias Gram positivas con respecto a bacterias Gram negativas, y a procedimientos de utilización.

Existen actualmente muy numerosos medios que permiten la detección de microorganismos. Esta detección se puede basar en particular en la utilización de sustratos particulares, específicos de una enzima del microorganismo que se desea detectar. De manera general, los sustratos sintéticos de enzimas están constituidos de tal manera que el sustrato y el producto de su metabolismo por la enzima diana poseen unas propiedades fisicoquímicas diferentes, que permiten distinguirlos y evaluarlos si todo o parte del sustrato se ha convertido en producto por la enzima. Los sustratos de hidrolizado están generalmente constituidos de una primera parte especifica de la actividad enzimática a revelar, y de una segunda parte que actúa como marcador, generalmente cromógeno o fluorescente. Así, en el caso de las bacterias mediante la selección de los sustratos, según haya reacción o no, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo. Se puede particularmente utilizar una actividad peptidasa para revelar un grupo, un género o una especie de bacterias. Así, la actividad alanina-aminopeptidasa, por ejemplo, permite diferenciar las bacterias Gram negativas de las bacterias Gram positivas.

Unos sustratos cromógenos enzimáticos para la detección de actividad peptidasa son conocidos en el estado de la técnica. Se puede citaren particular la publicación de Manafi (Manafi et al., Microbiol Rev 55(3): 335-348, 1991), que es una revista de sustratos enzimáticos utilizados en microbiología. Sin embargo, los sustratos de aminopeptidasa descritos liberan por hidrólisis unos compuestos que se difunden en el medio (beta-naftilamina, 7-amino-4- metilcumarina). De este modo, en el medio de reacción heterogéneo (colonias sobre cajas de Pétri, corte histológico, etc.), no es posible localizar precisamente el lugar de la hidrólisis Se pueden citar asimismo los sustratos descritos en las solicitudes de patente WO 98/4735 y WO 99/38995 depositadas por la solicitante. Sin embargo, a pesar de que estos sustratos se difunden poco en el medio de cultivo, estos presentan ciertos inconvenientes: su síntesis es difícil, la pureza está reducida, los rendimientos bajos y son tóxicos frente a ciertos microorganismos. Otros sustratos enzimáticos para la detección de actividad peptidasa se describen en la solicitud de patente FR 2916763.

La presente invención propone por lo tanto la utilización de nuevos compuestos, o bien a titulo de indicadores de pH, o bien a título de sustratos de peptidasa, que permiten la detección de microorganismos. Comparativamente a los sustratos existentes, estos nuevos compuestos son de síntesis fácil, y pueden ser utilizados en particular en medios gelificados para la detección de microorganismos ya que producen una coloración que se difunde poco o nada en el medio de reacción. En el ámbito de una utilización como sustrato enzimático, esto permite localizar una colonia o un orgánulo que expresa una actividad peptidasa entre otros que no lo expresan.

Antes de avanzar en la descripción de la invención, se dan a continuación las definiciones a fin de facilitar la descripción de la invención.

Por sustrato enzimático, se entiende un sustrato que puede ser hidrolizado por una enzima en un producto que permite la detección, directa o indirecta, de un microorganismo, de una célula o de un orgánulo. Este sustrato comprende en particular una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar y una segunda parte que actúa como marcador.

Los compuestos según la invención utilizados como sustratos son adecuados para una utilización en citometrla de flujo, ya que, al permanecer el producto de la hidrólisis principalmente localizado en la célula que expresa la actividad enzimática, es posible calcular específicamente las células que expresan esta actividad, incluso separarlas del resto de la muestra.

Los compuestos según la invención utilizados como sustratos son también muy adecuados para una utilización en histoenzimología, ya que al permanecer el producto de hidrólisis principalmente localizado en el medio de la hidrólisis, es posible identificar específicamente las células u orgánulos que expresan esta actividad dentro de un tejido.

Debido a su baja toxicidad, los compuestos según la invención son muy adecuados, respectivamente como indicadores de pH, o para el seguimiento de actividad peptidasa en cultivo celular.

Los compuestos según la invención son particularmente muy adecuados para una utilización en el medio de detección y/o de identificación, ya que producen una coloración o una fluorescencia que no se difunde en el medio de reacción.

En la presente solicitud el término coloración se utiliza para cubrir una coloración, absorción de luz en el espectro visible, o una fluorescencia, absorción a una longitud de onda (Aex) y emisión a una longitud de onda superior (Aem, Aem > Aex). Los compuestos de la invención pueden ser salificados, es decir en forma de sal tal como cloruro, bromuro, yoduro o trifluoroacetato.

Por indicador de pH, se entiende una sustancia química cuyo color y/o fluorescencia varía en función de las modificaciones de pH del medio, estando dichas modificaciones relacionadas o no con el metabolismo del o de los microorganismos en crecimiento sobre dicho medio.

Por peptidasa, se entiende una enzima capaz de escindir por hidrólisis el grupo amida formado entre el resto acilo de un péptido y una amina primaria. Por aminopeptidasa, se entiende una enzima capaz de escindir por hidrólisis el grupo amida formado entre un acilo de aminoácido y una amina primaria. En la presente solicitud, el término "peptidasa" puede designar, según los casos, tanto una peptidasa como una aminopeptidasa, tales como se han definido anteriormente.

Por péptido, se entiende una cadena peptídica que comprende de 1 a 1 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 4 aminoácidos. Preferiblemente, el péptido es una di-alanina o tri-alanina. Por aminoácido, se entiende cualquier aminoácido conocido por el experto en la materia, natural o no. Según un modo particular de realización de la invención, el aminoácido es una beta-alanina o L-alanina o D-alanina, o una Glicina, Pirroglutamil, etc.

Dicho péptido puede comprender un agente de bloqueo en su extremo N-terminal. Los agentes de bloqueo según la invención comprenden cualquier agente de bloqueo conocido por el experto en la materia que es capaz de proteger las aminas. A título de ejemplo, se puede citar el t-Butoxicarbonilo (N-tBOC), el 9-Fluoreniloxicarbonilo, un agente de solubilización tal como el succinilo, o bien un aminoácido no metabolizable, es decir no natural, tal como el ácido pipecólico o la forma D de un aminoácido, tal como la D-fenilalanina. Los agentes de bloqueo no están sistemáticamente presentes en los compuestos de la invención.

Por grupo alquilo, se entiende una cadena de grupos hidrocarbonados saturados, tal como en particular un alquilo de Ci-C6, es decir un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. A título de ejemplo, se puede citar el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el butilo, el t-butilo, el pentilo, el iso-pentilo y el hexilo.

Por grupo arilo, se entiende un grupo funcional (o sustituyente) que deriva de un núcleo aromático tal como en particular un núcleo aromático de C6-C1, en particular fenilo, bencilo, 1-naftilo o 2-naftilo.

Por grupo carboxilo, se entiende en particular un grupo funcional compuesto de un átomo de carbono, unido por un doble enlace a un primer átomo de oxígeno, y por un enlace simple a un segundo átomo de oxígeno, él mismo cargado negativamente o unido a un átomo de hidrógeno. En función del pKa de la molécula y del pH del medio, el grupo carboxilo puede estar en forma ionizada, es decir sin H unido al segundo átomo de oxígeno, que está entonces cargado negativamente.

Por medio de reacción, se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de un metabolismo... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un compuesto de la fórmula (I) siguiente, como sustrato enzimático para la detección de una actividad peptidasa y/o una variación de pH:

según la cual:

Yi es un péptido, H o un alquilo

Wi, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ésteres o amidas) o cualquier combinación de estos

n = , 1 o 2

U y V son N, N+R, CZ4, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

siendo Zi, Z2, Z3 y Z4 independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ésteres o amidas de carboxilo o sulfonilo

y sus sales.

2. Utilización de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 según la cual Y1 es un péptido, preferiblemente seleccionado entre la alanina y la glicina.

3. Utilización de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 o 2, según la cual n = 1

4. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, según la cual W1, W2, W3 y W4 son independientemente H.

5. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, según la cual U es CZ4, preferiblemente CH.

6. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, según la cual V es N+R, preferiblemente N+CH3.

7. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, según la cual Z1, Z2, Z3 y Z4 son H.

8. Utilización de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, según la cual dicho compuesto se selecciona entre cloruro de glicil-4-(4'-amidoestiril)-N-metil-piridinio, L-alanil-4-(4'-amidoestiril)-N-metil-piridinio TFA, cloruro de p- alanil-4-(4'-amidoestiril)-N-metil-piridinio, perclorato de L-alanil-4-(4'-amidoestiril)-piridina (sin cuaternizar).

9. Procedimiento para la detección en microorganismos de una actividad peptidasa y/o de una variación de pH, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a) disponer en un medio de detección y/o de identificación que comprende un compuesto de la fórmula (I) siguiente:

según la cual:

Yi es un péptido, H o un alquilo

Wi, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ásteres o amidas) o cualquier combinación de estos

n = , 1 o 2

U y V son N, N+R, CZ4, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

siendo Z1, Z2, Z3 y Z4 independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ásteres o amidas de carboxilo o sulfonilo

y sus sales.

b) inocular el medio con una muestra biológica a ensayar,

c) dejar incubar, y

d) revelar la presencia de al menos una actividad peptidasa o una variación de pH

1. Medio de detección y/o de identificación de microorganismos que comprende un compuesto de la fórmula (I) siguiente para detectar una actividad peptidasa y/o una variación de pH:

según la cual:

Y1 es un péptido, H o un alquilo

Wi, W2, W3 y W4 son independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, alcoxi, tiometilo, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo (incluyendo sus ásteres o amidas) o cualquier combinación de estos

n = , 1 o 2

U y V son N, N+R, CZ4, siendo R H, alquilo, aralquilo, arilo, alcanoico o alquilsulfónico

siendo Z1, Z2, Z3 y Z4 y Z5 independientemente H, Br, Cl, F, I, alquilo, arilo, alcoxi, perfluoroalquilo, nitro, ciano, carboxilo, sulfonilo, incluyendo los ásteres o amidas de carboxilo o sulfonilo

y sus sales.