Nanopartículas de protamina/ARN para inmunoestimulación.

Una composición farmacéutica que contiene nanopartículas de un tamaño medio de aproximadamente 50 a 450 nm que comprende protamina y ARN en combinación con un transportador,

vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en inmunoestimulación.

Nanopartïculas de protamina/ARN para inmunoestimulaciïn [0001] La presente invenciïn se refiere a nanopartïculas de Protamina/ARN inmunoestimulantes de un tamaïo promedio definido, a una composiciïn farmacïutica que contiene dichas nanopartïculas y a un procedimiento de producciïn de las mismas. Las nanopartïculas de la presente invenciïn son especialmente ïtiles como medicamento inmunoestimulante con un patrïn preciso de inmunoestimulaciïn diferente de la tïcnica previa.

Antecedentes de la invenciïn [0002] Ademïs de su funciïn principal como transportadores de la informaciïn genïtica, se ha reconocido recientemente que determinadas molïculas de ïcido nucleico son patrones moleculares asociados a patïgenos (PAMP) y se han usado como agentes para la estimulaciïn de la respuesta inmune innata del huïsped. Entre estas molïculas de ïcido nucleico inmunoestimulantes se incluyen desoxinucleïtidos (ADN) que comprenden el motivo CpG no metilado (oligodesoxinucleïtido CpG: ODN CpG) y ribonucleïtidos (ARN) en forma de ARN bicatenario (ARNbc) y molïculas de ARN monocatenario (ARNmc) protegidas o modificadas quïmicamente de otra manera. Se sabe que las diferentes familias de PAMP de ïcidos nucleicos (es decir, ODN CpG, ARNbc y ARNmc estabilizados) activan diferentes receptores similares a Toll (TLR) expresados por poblaciones celulares no solapantes (Jarrossay y col., 2001, Specialization and complementarity in microbial molecule recognition by human myeloid and plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol. 31: 3388-3393) y dan lugar a diferentes tipos de respuestas inmunes innatas caracterizadas por la secreciïn de un grupo especïfico de citoquinas.

Sin embargo, el ADN como adyuvante o como vehïculo de administraciïn de vacunas puede originar problemas de seguridad, por ejemplo, debido al riesgo de integraciïn del ADN dentro del genoma celular, lo que causa mutaciones que desregulan la expresiïn gïnica (inducen o impiden una expresiïn gïnica) . Dichas mutaciones tambiïn pueden ser transformantes, representando un grave riesgo de causar cïncer en el paciente.

Ademïs, el ODN CpG, la versiïn sintïtica del ADN de bacterias para la inmunoestimulaciïn, o el ADN bacteriano puede desencadenar varios efectos secundarios debido a la sobreestimulaciïn del sistema inmunitario (vïase p. ej., Heikenwalder y col. [2004] Nat. Med. 10:187-192) lo que se sabe produce esplenomegalia en ratones (Montheith y col., Anticancer Drug Res. 1997, 12 (5) : 421-432) . Asimismo, las molïculas de ADN se degradan con relativa lentitud en el torrente sanguïneo y, como tal, pueden inducir la formaciïn de autoanticuerpos (Gilkenson y col., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402) .

Recientemente se ha demostrado que el ARN estabilizado en forma de ARN mensajero (ARN) condensado sobre el pïptido catiïnico natural protamina o los oligorribonucleïtidos (ORN) sintïticos con una estructura molecular de fosforotioato son seïales de peligro para las cïlulas presentadoras de antïgeno (APC) de ratïn (vïase Scheel y col., Immunostimulating capacities of stabilized RNA molecules. Eur. J. Immunol. 2004. 34: 537-547, documento EP1806139 B1 para los oligonucleïtidos de ARN quïmicamente modificados y el documento Rep1818409 B1 para el ARNm protegido con protamina) .

En otras publicaciones, en lugar de protamina se usan lïpidos catiïnicos o polietilenimina (PEI) para proteger y transfectar el ARN. En Heil y col, Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and 8. Science 2004. 303: 1526-1529 y en el documento WO 03/086280 A2 se identificaron el TLR-7 murino y el TLR-8 humano como receptores de ORN fosforotioato administrados mediante liposomas. Especïficamente, se ha descrito que los oligonucleïtidos de ARNmc ricos en guanosina (G) y en uridina (U) derivados de VIH-1 estimulan la secreciïn de interferïn-α en cïlulas dendrïticas y macrïfagos, por lo que se reconoce que los oligonucleïtidos de ARNmc (ORN) ricos en GU son una clase de ligandos fisiolïgicos de TLR-7 y TLR-8. Diebold y col. (2004, Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science 303:1529-1531) describen que los ARNmc protegidos con PEI tambiïn inducen la producciïn dependiente de TLR7 de citoquinas inflamatorias y postularon que las cïlulas del sistema inmunitario innato son sensibles a los ARNmc endosïmicos para detectar la infecciïn por virus de ARN. Los mismos autores ademïs demostraron que los oligonucleïtidos de ARN administrados con PEI estimulan de forma preliminar a travïs de sus residuos U. Por otro lado, Hornung y col. (Nat. Med. 2005 mar; 11 (3) .263-70 y documento EP 1 764 107 A1) probaron muchos oligonucleïtidos de ARN administrados mediante liposomas catiïnicos y pudieron desarrollar a partir de estos resultados un algoritmo con el que se puede predecir la capacidad inmunoestimulante de las secuencias de ARN. Lund y col., Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. 101: 5598-5603, mostraron que los genomas de ARN monocatenario de virus (virus de la gripe, virus de la estomatitis vesicular) son reconocidos por TLR-7 en ratones. Finalmente, Kariko y col., mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J. Biol. Chem. 2004. 279: 12542-12550, demostraron que el ARNm estabilizado mediante encapsulaciïn en liposomas o mediante modificaciones 2' fluoro activa las cïlulas dendrïticas (CD) a travïs de TLR-3. Debido a que el ARNmc estabilizado activa la inmunidad innata, puede usarse como adyuvante de vacunas como se describe en Scheel y col., para oligonucleïtidos de ARN fosforotioato desnudo (Scheel, European Journal of Immunology, 2004) y Bourquin (Bourquin, Blood, 1 de abril de 2007, vol. 109, N.ï 7, pïg. 2953-2960) para los oligonucleïtidos de ARN encapsulados en liposomas.

Diebold y col., (Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single stranded RNA. Science 2004; 303: 1529-1531) mostraron que las molïculas de ARN protegidas por PEI estimulan a las CD plasmocitoides (CDp) de ratïn a travïs de TLR-7.

Mïs recientemente, Diebold y col. (2006) (Eur. J. Immunol. 36:3256-3267) indicaron que la uridina y la ribosa son ambas necesarias y suficientes para la estimulaciïn de TLR7 y que los ARNmc actïan como agonistas de TLR7 de forma independiente de la secuencia siempre que contengan varias uridinas prïximas. Dielbold y col. (2006) ademïs mostraron que, cuando se administra en endosomas, el ARN vïrico y autorreplicativo desencadenaba con similar eficacia la respuesta inmune innata mediada por TLR7, lo que apoyaba adicionalmente la nociïn de que la discriminaciïn entre los ligandos de ARN autorreplicativo y vïrico se basa en la accesibilidad endosïmica en lugar de una secuencia de ARN. Tambiïn se ha descrito recientemente que los ARNm transcritos a partir de los genes de la β-galactosidasa de E. coli o pp65 del CMV, cuando estïn formando complejos con la protamina, pueden inducir inmunidad antitumoral terapïutica en los ratones portador de tumores (Scheel y col. , 2006, Eur. J. Immunol. 36:2807-2816) .

No obstante, ninguna de las composiciones inmunoestimulantes a base de ARN anteriores es ïptima para aplicaciones clïnicas debido a que requieren formulaciones con liposomas catiïnicos que son inestables in vitro y tïxicos o con PEI que es tïxico (revisado por Hunter AC. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Dic 1;58 (14) :1523-31) o con protamina que proporciona agregados grandes heterogïneos (Scheel y col. (2005) , Eur. J. Immunol. 35: 1557-1566, vïase la fig. 1 del mismo) que precipitan rïpidamente y no son fïciles de coger con una jeringa ni de inyectar (sedimentan en el tubo y quedan atrapadas en la jeringa o en la aguja) . Ademïs, la mayorïa de estas formulaciones estïn hechas con oligonucleïtidos de ARN modificados que son extraïos para el organismo y pueden desencadenar una respuesta inmune contra la vacuna, es decir, una respuesta de anticuerpos especïficas para las modificaciones quïmicas del oligonucleïtido. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de una formulaciïn inmunoestimulante clïnicamente aceptable basada en ARN sin modificar como principio farmacïutico activo. Es objeto de la presente invenciïn proporcionar procedimientos y composiciones para superar las anteriores deficiencias de la tïcnica previa. Puesto que se basa en nanopartïculas homogïneas bien definidas, la presente ïcomposiciïn de nanopartïculas de ARNprotamina inmunoestimulantesï es adecuada para la formulaciïn farmacïutica y para cualquier tipo de inyecciïn, incluso por vïa intravenosa.

Por otro lado, es sabido que los inmunoestimulantes a base de ïcidos... [Seguir leyendo]

1. Una composiciïn farmacïutica que contiene nanopartïculas de un tamaïo medio de aproximadamente 50 a 450 nm que comprende protamina y ARN en combinaciïn con un transportador, vehïculo y/o diluyente farmacïuticamente aceptable para su uso en inmunoestimulaciïn.

2. La composiciïn para su uso de la reivindicaciïn 1 en la que la proporciïn en peso de protamina con respecto al ARN es de 8:1 a 1:2, preferiblemente de 4:1 a 1:2.

3. La composiciïn para su uso de la reivindicaciïn 1 o 2 en la que el ARN contiene al menos un nucleïtido U y/o al menos un nucleïtido G.

4. La composiciïn para su uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el ARN es un oligonucleïtido de 6 a 100 nucleïtidos.

5. La composiciïn para su uso de la reivindicaciïn 3 o 4 en la que el ARN es un oligonucleïtido que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEC ID N.ï 1, 2, 3, 5, 10, 11, 12 y 13.

6. La composiciïn para su uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el ARN es un ARNm de 10 a 10 000 nucleïtidos.

7. La composiciïn para su uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la que la composiciïn ademïs contiene al menos un antïgeno.

8. La composiciïn para su uso de la reivindicaciïn 7 en la que el antïgeno se selecciona a partir del grupo compuesto po.

70. AP, AFP, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT) , iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 menor bcr-abl, Pml/RAR.alfa, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.

9. La composiciïn para su uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la que la composiciïn farmacïutica ademïs contiene al menos un adyuvante.

10. La composiciïn para su uso de la reivindicaciïn 9 en la que el adyuvante es un aceite.

11. La composiciïn para su uso segïn una cualquier de las reivindicaciones 1 a 10 en la que la composiciïn se administra conjuntamente con un agente inmunomodulador adicional seleccionado a partir del grupo compuesto por fïrmacos quimioterapïuticos, cloroquina, reactivos anti-CTLA-4 o anti-cïlulas T reguladoras.

12. Un procedimiento para la preparaciïn de nanopartïculas de un tamaïo medio de 50 a 450 nm que comprende los pasos de:

a) proporcionar una soluciïn acuosa de ARN

1) a 1 mg/ml o mïs usando una soluciïn que contiene de 0 a 75 nM de electrolitos, o 2) a menos de 1 mg/ml usando una soluciïn que contiene de 0 a 75 nM de electrolitos;

b) proporcionar una soluciïn acuosa de protamina 1) a 1 mg/ml o mïs usando una soluciïn que contiene de 0 a 75 mM de electrolitos; o 2) a menos de 1 mg/ml usando una soluciïn que contiene de 0 a 75 mM de electrolitos; y

c) combinar las soluciones obtenidas en los pasos a1) y b1) o mezclar las soluciones obtenidas en a2) y b2) .

13. El procedimiento de la reivindicaciïn 12 en el que los pasos a1) y/o a2) comprenden resuspender el ARN liofilizado en una soluciïn acuosa que contiene de 0 a 75 mM de electrolitos.

14. El procedimiento de la reivindicaciïn 12 o 13 en el que los pasos b1) y/o b2) comprende diluir una soluciïn stock isotïnica acuosa que contiene de 1000 a 5000 unidades neutralizantes de heparina de protamina por ml con una soluciïn acuosa que contiene de 0 a 75 mM de electrolitos.

15. El procedimiento de la reivindicaciïn 13 o 14 que comprende las etapas de: a) proporcionar una soluciïn acuosa de ARN a menos de 2 mg/ml resuspendiendo el ARN liofilizado en agua pura; b) proporcionar una soluciïn acuosa de protamina a menos de 2 mg/ml diluyendo una soluciïn stock isotïnica acuosa que contienen 5000 unidades neutralizantes de heparina de protamina por ml con agua pura; y c) combinar las soluciones obtenidas en los pasos a) y b) .