Nanoesferas recubiertas de plasminógeno como soporte directo de amplificación cíclica de la proteína priónica PrPsc.

Procedimiento in vitro de detección de un confórmero patógeno de la proteína priónica (PrPSC) en una muestra,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:

a) poner en contacto nanoesferas recubiertas de plasminógeno con una muestra;

b) separar dichas nanoesferas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPsc eventualmente presente, de la muestra;

c1) poner en contacto dichas nanoesferas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPSC eventualmente presente, obtenidas en la etapa b) con una preparación que comprende confórmero no patógeno de la proteína priónica (PrPC);

c2) desagregar los agregados formados eventualmente durante la etapa c1);

d) detectar la presencia de PrPSC en la preparación, siendo la presencia de PrPSC en la preparación indicativa de la presencia de PrPSC en la muestra;

formando las etapas c1) y c2) un ciclo que se repite al menos dos veces antes de implementar la etapa d).

Nanoesferas recubiertas de plasminógeno como soporte directo de amplificación cíclica de la proteína priónica PrPsc.

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de detección de un confórmero patógeno de la proteína priónica en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento una etapa previa de captura del confórmero patógeno mediante puesta en contacto de la muestra con nanoesferas recubiertas de un ligando del confórmero patógeno, a continuación la implementación de una amplificación cíclica de la proteína priónica mal

plegada directamente sobre el soporte sólido que ha capturado el confórmero patógeno, y la detección de la presencia de confórmero patógeno. La invención también se refiere a un kit para la implementación de este procedimiento.

Las enfermedades conformacionales constituyen un grupo de enfermedades no emparentadas entre sí pero que comparten los mismos mecanismos moleculares que implican la transición conformacional de una proteína existente (confórmero no patógeno) hacia un plegamiento aberrante (confórmero patógeno) que conduce a agregaciones proteicas y la formación de depósitos tisulares.

Son ejemplos típicos de estas enfermedades las encefalopatías espongiformes transmisibles y la enfermedad de Alzheimer. Las encefalopatías espongiformes transmisibles son relativamente raras en seres humanos pero fueron objeto de una atención particular cuando se revelaron los riesgos de transmisión de la forma bovina de la encefalopatía espongiforme al hombre, a través de la cadena alimentaria. La variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ) es la contrapartida humana de la encefalopatía espongiforme bovina.

A principios del año 2010, se habían catalogado 246 casos primarios de vECJ en 11 países diferentes. Aunque la incidencia clínica de la vECJ sigue siendo reducida, la prevalencia global de la enfermedad en la fase preclínica es evaluada en 1:4000 en Reino Unido. La proteína priónica celular normal (PrPc) , que experimenta una transición conformacional hacia un confórmero patógeno anormalmente plegado (PrPSC) , está en el origen de las encefalopatías espongiformes transmisibles. La proteína PrPSC se encuentra principalmente a nivel del cerebro y de los órganos linfáticos de los animales infectados, pero también puede detectarse en numerosos tejidos que incluyen el músculo esquelético, el hígado, el páncreas, los riñones, el útero y la piel.

Esta distribución periférica de la PrPSC plantea el problema de la transmisión potencial entre individuos de la variante de la ECJ, mediante cirugía o procedimiento médico invasivo, tal como la transfusión sanguínea o los trasplantes.

Es, por lo tanto, particularmente importante poder detectar de manera sensible y específica las donaciones de sangre que hubieran podido ser recogidas a partir de pacientes afectados por la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. El control sanitario de los alimentos de origen animal (leche, carnes) es también importante.

De forma más general, el desarrollo de un procedimiento altamente sensible y específico para detectar confórmeros patógenos de enfermedades priónicas presenta una utilidad para el diagnóstico de estas enfermedades en pacientes, en particular cuando están todavía en una fase asintomática.

La capacidad de la proteína priónica PrPSC de catalizar la transformación del confórmero no patógeno en un confórmero patógeno se aprovechó para desarrollar un procedimiento de detección de confórmeros patógenos mediante amplificación cíclica. Esta tecnología, llamada “amplificación cíclica de proteínas mal plegadas” (PMCA) también ha sido descrita por Saborio et al. (Nature, 2001, 401 (6839) : 810-3) . La amplificación cíclica se basa en la 50 conversión de un sustrato constituido por confórmeros no patógenos mediante cantidades no detectables de confórmeros patógenos, para obtener niveles de confórmeros patógenos detectables mediante procedimientos convencionales tales como inmunotransferencias (immunoblots) . Esto se hace posible mediante la repetición de ciclos de incubación del confórmero patógeno en presencia del confórmero no patógeno, que permiten incrementar la cantidad de confórmero patógeno, seguida de la desagregación de los agregados formados, para hacer

accesibles a los confórmeros patógenos para catalizar la conversión de nuevos confórmeros no patógenos.

Sin embargo, la amplificación cíclica de la proteína PrPSC directamente a partir de la sangre, sigue siendo difícil, particularmente debido a los grandes volúmenes de muestras requeridos para permitir una detección y debido a la presencia en la sangre de inhibidores de la proteína PrPSC .

Para remediar estos problemas, los inventores intentaron desarrollar una metodología de PMCA mejorada, con una etapa previa de concentración de la proteína PrPSC .

Ensayos realizados utilizando fosfotungstato de sodio o sulfato de estreptomicina, aunque condujeron efectivamente a una concentración de la proteína PrPSC, no permitieron a continuación una amplificación eficaz del confórmero patógeno PrPSC por PMCA.

Los inventores han conseguido desarrollar un procedimiento extremadamente sensible de detección de la proteína PrPSC, basado en la captura del confórmero patógeno de la proteína priónica presente en la muestra a analizar, con ayuda de un soporte sólido constituido por nanoesferas recubiertas de plasminógeno, seguida de la amplificación directa del confórmero patógeno unido al soporte sólido mediante PMCA, a continuación detección de los confórmeros patógenos amplificados.

Recientemente se ha descrito que nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro tenían la capacidad de unirse selectivamente a la proteína PrPSC (Miller y Supattapone, J. Virol. 12 de enero de 2011. [Publicación electrónica previa a la impresión]) . La capacidad de la proteína PrPSC de unirse a las nanopartículas se puso de manifiesto implementando un ciclo de amplificación PMCA directamente sobre las nanopartículas que se han unido a PrPSC. Este artículo sugirió que la implementación de una etapa de concentración mediante unión de PrPSC con las nanopartículas magnéticas, acoplada a una PMCA, podría mejorar la detección de concentraciones reducidas de proteínas priónicas. Los niveles de amplificación mostrados después de 72 horas de PMCA siguen siendo, sin embargo, muy reducidos, no dando 5 μl de cerebro al 5% ninguna señal sin PMCA y dando una señal muy débil con PMCA para la cepa RML de ratones CD1, y una señal débil para la cepa 237 de hámster.

Por otro lado, se ha descrito que el plasminógeno actúa como un cofactor que estimula la conversión de la proteína PrPC, estando la velocidad de producción de PrPSC multiplicada por aproximadamente 2, 5 en presencia de 0, 5 μM de plasminógeno humano en el medio de reacción de PMCA (Mays y Ryou, Prion. 2011; 5 (1) : 22-7; Mays y Ryou, FASEB J. 2010; 24 (12) : 5102-12) .

El principio de la implementación de una amplificación PMCA después de concentración de la proteína PrPSC con ayuda de esferas recubiertas de un ligando de la proteína PrPSC ha sido descrito por los inventores (Transfusion Clinique et Biologique 2009, 16 (3) : 295) , sin identificar, sin embargo, la naturaleza del ligando utilizado.

Ahora bien, se han identificado varios tipos de ligando de la proteína PrPSC e incluyen particularmente ácidos nucleicos aptámeros (Sayer et al., J. Biol. Chem. 2004, 279 (13) : 13102-13109) , anticuerpos anti-ADN (Zou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 2004, 101: 1380-1385) , anticuerpos monoclonales anti-PrPSC, (Korth et al., Nature 1997, 390: 74-77, y Paramithiotis et al., Nat. Med. 2003, 9: 893-899) y ligandos polianiónicos (solicitud de patente internacional WO 03/073106) .

Los inventores han demostrado de este modo, de manera inesperada, que el plasminógeno unido a nanoesferas permite unir los confórmeros patógenos PrPSC y que estos siguen siendo accesibles para la conversión de confórmeros no patógenos PrPC en confórmeros patógenos PrPSC .

La especificidad del plasminógeno por la proteína PrPSC es controvertida, habiéndose descrito a la vez

que el plasminógeno se une exclusivamente a la proteína PrPSC (véase por ejemplo Fischer et al. Nature 2000, 408 (6811) : 479-483; Maissen et al., The Lancet, ) ) mientras que otros trabajos mostraron que el plasminógeno se unía también a la proteína PrPC (Cuccioloni et al., Proteins 2005; 58 (3) : 728-734) .

De este modo, la solicitud WO 02/00713 describe que el plasminógeno se une a PrPSC y que puede 50 emplearse en un procedimiento de concentración... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro de detección de un confórmero patógeno de la proteína priónica (PrPSC) en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:

a) poner en contacto nanoesferas recubiertas de plasminógeno con una muestra; b) separar dichas nanoesferas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPsc eventualmente presente, de la muestra; c1) poner en contacto dichas nanoesferas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPSC eventualmente presente, obtenidas en la etapa b) con una preparación que comprende confórmero no patógeno de la proteína priónica (PrPC) ; c2) desagregar los agregados formados eventualmente durante la etapa c1) ; d) detectar la presencia de PrPSC en la preparación, siendo la presencia de PrPSC en la preparación indicativa de la presencia de PrPSC en la muestra;

formando las etapas c1) y c2) un ciclo que se repite al menos dos veces antes de implementar la etapa d) .

2. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que la etapa d) es precedida por una etapa d1) de destrucción o eliminación de la proteína PrPC presente en la preparación al final de la etapa c2) .

3. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1 ó 2, en el que las nanoesferas son nanoesferas paramagnéticas recubiertas de plasminógeno a razón de 10 a 30 μg de plasminógeno/mg de nanoesferas.

4. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las nanoesferas recubiertas de plasminógeno se ponen en contacto con la muestra en la etapa a) a una proporción de: 2, 5 a 90 ml 25 de suspensión de nanoesferas al 1% (peso/volumen) para de 50 a 500 ml de muestra.

5. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa a) se realiza con agitación y la desagregación de la etapa c2) se realiza mediante sonicación.

6. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto nanoesferas paramagnéticas recubiertas de plasminógeno con una muestra, a razón de 10 a 30 μg de plasminógeno/mg de nanoesferas paramagnéticas;

b) separar dichas nanoesferas paramagnéticas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPSC eventualmente presente, de la muestra; c1) poner en contacto, durante de 20 minutos a 2 horas, dichas nanoesferas paramagnéticas recubiertas de plasminógeno que portan la PrPSC eventualmente presente, obtenidas en la etapa b) , con una preparación que comprende confórmero no patógeno de la proteína priónica (PrPC) ;

c2) desagregar por sonicación los agregados eventualmente formados durante la etapa c1) durante de 10 segundos a 1 minuto; d) detectar la presencia de PrPSC en la preparación, siendo la presencia de PrPSC en la preparación indicativa de la presencia de PrPSC en la muestra; formando las etapas c1) y c2) un ciclo que se implementa de 50 a 350 veces antes de implementar la etapa d) .

7. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

-un primer ciclo de amplificación en el que la etapa c1) se implementa durante de 60 a 120 minutos y la etapa c2) se implementa mediante sonicación durante de 10 segundos a 1 minuto, y a continuació.

50. uno o varios ciclos de amplificación en los que la etapa c1) se implementa durante de 30 a 60 minutos.

8. Procedimiento in vitro según la reivindicación 7, que comprende:

-un primer ciclo de amplificación durante el cual la etapa c1) se implementa durante de 80 a 100 minutos, y la

etapa c2) se implementa mediante sonicación durante de 20 a 40 segundos, y a continuación -de 49 a 99 ciclos de amplificación durante los cuales la etapa c1) se implementa durante de 30 a 60 minutos, y la etapa c2) se implementa mediante sonicación durante de 20 a 40 segundos.

9. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha muestra es

una muestra biológica de un sujeto y la detección de la presencia de PrPSC en la etapa d) es indicativa de una enfermedad, encefalopatía espongiforme transmisible, en el sujeto.

10. Procedimiento in vitro según la reivindicación 9, en el que la encefalopatía espongiforme transmisible 5 es la enfermedad de Creutzfeld Jacob o su variante.

11. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha muestra es un fluido o sólido alimentario y la detección de la presencia de PrPSC en la etapa d) es indicativa de un fluido o sólido alimentario contaminado por el confórmero patógeno PrPSC .

12. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha muestra es, o procede de, una extracción de sangre, de plasma o de un órgano y la detección de la presencia de PrPSC en la etapa d) es indicativa de una extracción de sangre o plasma inapropiada para transfusión, o de un órgano inapropiado para trasplante.

13. Procedimiento in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa d) comprende la cuantificación de dicho confórmero patógeno.

14. Utilización de un kit que comprende: 20

-nanoesferas paramagnéticas;

-plasminógeno;

-una cantidad conocida de confórmero no patógeno de la proteína priónica PrPC,

para la implementación de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Utilización de un kit según la reivindicación 14, que comprende además al menos otro ligando de un confórmero patógeno de la proteína priónica PrPSC .