Métodos para obtener plantas resistentes a sequía.

La presente invención provee un método no tóxico para la selección de células transformadas de entre una población que consiste de células transformadas y no transformadas.

El método comprende los siguientes pasos: a) introducir a una célula al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una secuencia que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena; b) colocar la población con células transformadas y no transformadas en un medio de cultivo que contiene una sustancia osmoreguladora como el PEG 8000 y c) seleccionar las células transformadas de la población en base a la capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en presencia de la sustancia osmoreguladora, confiriendo a las plantas derivadas de estos eventos de transformación genética, por ejemplo de capacidad de tolerancia a sequía y frío.

Métodos para obtener plantas resistentes a sequía Campo de la invención.

La presente Invención pertenece al área de la ingeniería genética, específicamente a los procesos de transgénesis y cisgénesis de plantas y tejido de origen vegetal y más particularmente a métodos para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas evitando utilizar como marcador de selección genes de resistencia a sustancias tóxicas, y sin necesidad de que la célula transformada produzca una proteína y/o un metabolito nuevo o diferente que tenga un efecto negativo potencial en la célula vegetal, en la planta o en sus consumidores finales e intermediarios. De esta manera, en el método de la presente invención se utiliza una secuencia nucleotídica de selección que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena, confiriendo a las plantas derivadas de este método de selección la capacidad de tolerancia a la sequía.

Antecedentes de la invención.

Se sabe que cuando un material genético se introduce en una población celular por medio de transformación, solamente cierto número de células será transformado exitosamente. Después de la transformación, las células transformadas deben de ser identificadas y 20 seleccionadas de entre una población de células transformadas y no transformadas. La identificación y separación de las células transformadas se ha llevado a cabo tradicionalmente utilizando métodos de "selección negativa", donde las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer, mientras que las células no transformadas son sujetas a una inhibición del crecimiento o a su eliminación por una sustancia a la cual, las células transformadas, en virtud de su transformación, son capaces de tolerar. Generalmente para este propósito se introduce también a la célula un gen de selección, además del transgen de interés. Este gen de selección típicamente provee resistencia a un antibiótico o a un herbicida, con la que las células genéticamente transformadas pueden ser identificadas. Después de la transformación, la población de células transformadas y no transformadas se cultivan entonces en un medio de cultivo que contiene el antibiótico o herbicida al cual las células transformadas son resistentes, en virtud del gen de selección, permitiendo así que las células no transformadas que no contienen el gen de resistencia al antibiótico o herbicida, queden sujetas a la inhibición del crecimiento, y solamente las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer debido a la presencia del gen de selección introducido. Entre estos ejemplos podemos citar las patentes US6174724 y EP0131623 que utilizan como marcador de selección el gen que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa tipo 11 (nptll) , la cual confiere resistencia a ciertos antibióticos de la familia de los aminoglicosidos (kanamicina, neomicina, G418, paromomicina) , así como la patente US4727028 que utiliza el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) para dar resistencia al antibiótico higromicina.

lO A pesar de su efectividad observada, los métodos de selección negativa tienen ciertas desventajas. Por ejemplo, las células no transformadas mueren debido a la presencia de antibióticos o herbicidas en el medio de crecimiento, y como resultado existe el riesgo de que no solamente las células no transformadas sino también las células transformadas puedan morir, debido a que las células no transformadas dañadas o en proceso de eliminación pueden excretar compuestos tóxicos. Otra desventaja de gran importancia es que generalmente el uso de tales genes de selección que proveen la resistencia a un compuesto tóxico no es recomendable, desde el punto de vista ambientalista y de seguridad alimentaria, para los cultivos transgénicos y cisgénicos que son introducidos y liberados a gran escala en el medio ambiente,

particularmente los cultivos alimenticios. Una desventaja adicional de la selección negativa es que las células o tejidos vegetales tratados con sustancias tóxicas se vuelven más susceptibles a la infección bacterial. Esto representa un problema cuando se utiliza Agrobacterium como vector de transformación, debido a que los tejidos o células algunas veces pueden tener sobre-crecimiento de la bacteria a pesar de que se utilizan antibióticos para prevenir el crecimiento. Dentro de los métodos de selección positiva podemos citar las patentes US6444878 y US5767378 que emplean genes para el metabolismo de compuestos que resultan tóxicos para la célula. La primera patente describe el uso de una secuencia nucleotídica que codifica para la actividad glucosamina-6-fosfato desaminasa, como gen de resistencia de células genéticamente transformadas que crecen en un medio de cultivo que contiene el metabolito tóxico glucosamina o uno de sus derivados. La segunda patente describe el uso de un grupo de genes que codifican fosfomanoisomerasas, fosfomanomutasas, manosaepimerasas, etc., involucrados en el metabolismo de la manosa, o de sus derivados o precursores; así como la adición de alguno de dichos compuestos tóxicos en el medio de cultivo de selección. En ambos casos, al igual que en el uso de genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, se lleva a que la célula genéticamente transformada produzca una proteína extraña que además de que puede resultar ser un alergeno implica un gasto metabólico para el organismo transformado que ya ha sido seleccionado y no requiere más de este producto. Recientemente, en la patente US7449290 se describe un método de selección de células transformadas genéticamente donde se utiliza como marcador de selección una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que tiene actividad de trehalasa, la cual cataliza la azúcar trehalosa o de sus derivados metilados o halogenados. En este método se sobreexpresa la enzima trehalasa para permitir a la célula genéticamente transformada sobrevivir a concentraciones tóxicas del metabolito agregado al medio de selección. Al igual que en los casos anteriores, el organismo genéticamente modificado presenta una sobreproducción de una proteína que le es innecesaria después del proceso de selección, e implica también la adición de un compuesto extra al medio de cultivo de selección. Las desventajas mencionadas anteriormente pueden superarse, al menos de manera substancial, mediante una selección positiva con el método de acuerdo a la presente invención, la cual hace posible identificar y aislar células transformadas genéticamente sin eliminar por intoxicación a las células no transformadas de la población y sin la cointroducción de genes de resistencia a antibióticos, herbicidas y otros compuestos, además de suprimir la necesidad de agregar al medio de cultivo un compuesto extra. El método de acuerdo a la presente invención evita también la producción extra de una proteína o polipéptido, que al final del proceso de selección le resulta innecesaria. En las patentes US7214858 y US7560613 se describen fragmentos de ácidos nucleicos que codifican enzimas que intervienen en el metabolismo de la trehalosa en las plantas y semillas con el fin de obtener plantas modificadas genéticamente. Se propone el uso de secuencias de genes como: trehalasa, trehalosa fosfato sintetasa y trehalosa 6-fosfatofosfatasa. En dichos documentos solo se presentan evidencias experimentales en plantas transgénicas que expresan trehalosa 6-fosfato-fosfatasa, sin presentarse evidencias experimentales para el caso del gen que codifica para la trehalasa. A pesar de ello, Perr y y colaboradores realizan análisis de alineamientos de secuencias de la enzima trehalasa de G/yeine max, Neurospora erassa, maíz y soya y es a partir de estos estudios computacionales donde proponen el uso del gen de la trehalasa para producir plantas modificadas genéticamente donde el metabolismo de la trehalosa puede ser alterado en las plantas, pero sin sugerir siquiera su uso como un método de selección. Por lo anterior, es necesario proporcionar métodos eficientes que permitan obtener células transformadas genéticamente sin la introducción de genes extraños, evitando con ello la producción innecesaria de proteínas y/o péptidos ajenos a dichas células y que le resultan innecesarias.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se observa un mapa de la unidad de expresión génica para transformar

maíz.

Figura 2. Se observa la estrategia para generar plantas transgénicas de maíz

tolerantes a PEG 8000 mediante el uso de callos embriogénicos y

biobalística.

Figura 3. Se observa la selección de semillas tolerantes a PEG 8000 simulador de

sequía en la T1 y comprobación de la inserción molecular de la unidad

funcional correspondiente al 35S NPTII....

1. Un método para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células, sin el uso de genes de selección que codifiquen para la resistencia a antibióticos, herbicidas y/o sustancias tóxicas para la célula, caracterizado por comprender las siguientes etapas:

a) introducir a una célula o población de células al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena; b) colocar la población de células transformadas y no transformadas en contacto con un medio de cultivo que contenga un agente osmoregulador en cantidad suficiente para que ésta sobreviva; y c) seleccionar en base a la ventaja competitiva al menos una porción de células transformadas genéticamente sobre las células no transformadas, donde dichas células genéticamente transformadas llevan una secuencia nucleotídica que codifica para un inhibidor de la trehalasa dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, en donde el RNA producido por dicha secuencia nucleotídica introducida le confiere una ventaja competitiva en el medio de cultivo con el agente osmoregulador.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es una secuencia nucleotídica que codifica para una trehalasa, dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

3. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa (Medicago sativa) y/o una secuencia que codifica para la trehalasa de maíz.

4. El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia

nucleotídica de selección es complementaria, más específicamente, al gen o a una región del gen MSTRE1 , de SEO ID NO: 17, de la trehalasa de alfalfa.

5. El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde el RNA transcrito a partir de la secuencia nucleotídica de selección es complementaria en forma completa o parcialmente al RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

6. El método de acuerdo a la reivindicación 5, donde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada.

7. El método de acuerdo a la reivindicación 1, dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Perip/aneta americana) , para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, la sudatestrina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.

8. El método de la reivindicación 1, donde el medio de cultivo comprende un agente osmoregulador seleccionado entre: Polietilenglicol 8000 (PEG8000) , manitol, sorbitol, NaCI o cualquier otro agente osmoregulador.

9. El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende Polietilenglicol 8000 (PEG8000) como agente osmoregulador.

10. El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende PEG8000 a una concentración del 4 %.

11. El método de las reivindicaciones anteriores, dónde la célula vegetal genéticamente transformada se selecciona de plantas tales como: tomate (Lycopersicum escu/entum L.) , mango, durazno, manzana, pera, banana, melón, girasol, tabaco, caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) trigo (Triticum aestivum L) , soya (G/ycine max L.) , cebada, maíz (Zea mays L.) , algodón, papa (So/anum tuberosum L.) , zanahoria, lechuga, calabaza, cebolla, entre otras.

12. El método de las reivindicaciones 1-11, dónde la célula seleccionada es una célula vegetal genéticamente transformada que tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha célula es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía.

13. El método de acuerdo a la reivindicación 1, donde la célula o población de células es además transformada con una secuencia nucleotídica de interés.

14. El método de acuerdo a la reivindicación 13, donde la secuencia nucleotídica de interés introducida puede ser una secuencia que codifique para la enzima trehalosa-6fosfato sintasa (TPS) , para la enzima trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) , un inhibidor de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) y/o una secuencia nucleotídica que codifique para la resistencia a toxinas, antibióticos, herbicidas u otros productos de interés biotecnológico.

15. El método de acuerdo la reivindicación 1, donde la transformación de las células vegetales se lleva a cabo mediante una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés Y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

16. El método de acuerdo a las reivindicación 1 y 15, donde la construcción o vector molecular una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena; una o dos copias de la misma, en un arreglo tal que inhiba la actividad trehalasa endógena, y donde dicha construcción puede comprender elementos adicionales como una secuencia de unión entre las copias de la secuencia introducida sea complementaria a la secuencia del DNA de la trehalasa endógena, como por ejemplo un RNA de interferencia (RNAi) .

17. Una célula vegetal genéticamente transformada caracterizada por comprender una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

18. La célula como se declara en la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, siendo ésta la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica

introducida produce un RNA que es complementario al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

19. La célula de acuerdo a la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, preferentemente a la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa MSTRE1, de SEO ID NO: 17.

20. La célula de acuerdo a la reivindicación 19, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, confiriéndole a la célula transformada una ventaja competitiva en el medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador.

21. La célula según la reivindicación 18, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia nucleotídica o una región del gen de la trehalasa de maíz.

22. La célula según la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.

23. Una planta regenerada a partir de una célula vegetal genéticamente transformada conforme a las reivindicaciones 17-21 , la cual comprende una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

24. La planta conforme a la reivindicación 22, donde la planta tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha planta es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía y/o frío.

25. Las semillas de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.

26. La progenie de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.

27. Un vector o construcción molecular para transformar genéticamente una o varias células vegetales, el cual comprende un promotor vegetal operable unido al menos con una secuencia nucleotídica de selección que codifica para un inhibidor de la trehalasa y/o al menos una secuencia nucleotídica de interés.

28. El vector de acuerdo a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, dicha secuencia puede seleccionarse de una secuencia del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa y/o de la secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena como por ejemplo una secuencia nucleotídica que codifica para la trehalasa de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida, produce un RNA que es al menos parcialmente complementario al RNA producido por una secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena.

29. El vector de la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para un inhibidor de la trehalasa, la cuál tiene homología con la secuencia MSTRE1, de SEO ID NO: 17.

30. El vector conforme a la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena.

. El vector conforme a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kO de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones.

32. El vector conforme a la reivindicación 27, el cual comprende además una secuencia nucleotídica que codifica genes involucrados a la resistencia a toxinas, antibióticos o herbicidas.

33. El vector de acuerdo a las reivindicacione.

2. 31 útil para la transformación de células vegetales, para la selección de células genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas y para la producción de plantas genéticamente transformadas.

34. Uso del Polietilenglicol 8000 (PEG 8000) para preparar un medio de cultivo osmoregulado para la selección de células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas, donde el genoma de las células transformadas comprende al menos una secuencia nucleotídica de selección que comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa.

35. El uso de la reivindicación 33 donde la concentración del Polietilenglicol 8000 es del 4%.

EcoRV

Promotor Tre AS PoliA T-g

EcoRI EcoRI

FIGURA 1

Callos embnogemcos de matz

SelecctOn de clonas transgentcas de la linea pura 873

tolerantes al PEG 8000 al 4%

Transforrnacion genetica medianie biobahstica e Plantas transgenicas en condiciones de invernadero

Mazorcas geneticamente modificadas I

FIGURA 2

Anatists de hibridacion mediante la tecnica del Southern y Blot de lineas transgenicas de maiz tolerantes al PEG 8000

Sonda promotor 35S. gene NPTII 1.8 Kb

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FIGURA 12 FIGURA 6

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FIGURA 9

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8 14 20 26 32 38 44 50 56 62 68 1 96 114 128 InducciOn de sequia Tiempo 143 1.5! (dias)

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