Método para preparar pimientos transgénicos utilizando la inducción del callo.

Un método para producir plantas de pimiento transgénicas, comprendiendo el método las etapas de:

(a) pre-cultivar explantes de pepino en un medio de inducción del callo;

(b) co-cultivar los explantes pre-cultivados con Agrobacterium en el que se ha introducido un gen diana;

(c) cultivar los explantes co-cultivados en un medio de selección con el fin de formar un callo y seleccionar el callo formado; y

(d) cortar el callo y cultivar el callo cortado en un medio de inducción de brotes con el fin de formar brotes.

Método para preparar pimientos transgénicos utilizando la inducción del callo CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método para producir plantas de pimiento transgénicas y, más particularmente, a un método para producir en masa plantas de pimiento transgénicas utilizando la inducción del callo, estando caracterizado el método por las etapas de: pre-cultivar explantes de pimiento; co-cultivar los explantes de pimiento pre-cultivados con Agrobacterium en los que se ha introducido un gen diana; seleccionar el callo; y formar brotes.

TÉCNICA DE ANTECEDENTES

El pimiento es uno de los principales cultivos en el mundo y es ampliamente utilizado como alimento o condimento. Además, el pimiento se utiliza en tintes industriales, en particular se utiliza como materia prima principal de lápices de labios cosméticos. La cantidad anual de ventas totales de productos del pimiento en Corea es de aproximadamente dos trillones de won en moneda coreana y forma el mercado de semillas más grande de Corea. El pimiento es el cultivo más adecuado para ser capaz de crear un alto valor añadido en relación con el uso de biotecnología.

La primera puerta de entrada a utilizar el pimiento en biotecnología es llevar a cabo la transformación. Sin embargo, el pimiento se conoce como un cultivo que es muy difícil de ser transformado debido a las dos razones siguientes. En primer lugar, la probabilidad de éxito de la regeneración en plantas de pimiento transgénicos varía definitivamente en función de las líneas de semillas (Christopher, T et al., Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46: 245,1996;.

Kim, JY et al., J. Plant Biotechnol., 4: 129, 22). Dado que una alta tasa de transformación sólo se obtiene en líneas de semillas con una elevada tasa de regeneración, es muy difícil transformar líneas de semillas con una baja tasa de regeneración. En segundo lugar, la tasa de infección de Agrobacterium varía dependiendo de los cultivos. Se infiere que los cultivos, que son difíciles de transformar, son el caso en el que el pilus de Agrobacterium es impermeable a las células de tejido de explantes o no son inoculados lo suficientemente a las células de tejido.

Los casos de éxito en la transformación del pimiento siguen siendo raros en todo el mundo. Un método para transformar plantas de pimiento utilizando Agrobacterium fue reseñado por primera vez en EE.UU. (patente de EE.UU. N° 5.262.316), y también fue estudiado por Sung-Han Son, et al. en Corea (Registro de patente coreana N° 344573). Sin embargo, estos métodos tienen desventajas, debido a que muestran una muy baja tasa de transformación, no son reproducibles y hacen que sea difícil producir en masa plantas de pimiento transgénicas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Durante extensos estudios realizados por los autores de la invención para producir en masa plantas de pimiento transgénicas con alta eficiencia, éstos han encontrado que, cuando los explantes de pimiento son regenerados mediante pre-cultivo en el medio de inducción del callo, seguido de co-cultivo con Agrobacterium, se puede obtener fácilmente pimiento transgénico, completando con ello la presente invención.

Por consiguiente, un objeto principal de la presente invención es proporcionar un método para producir en masa plantas de pimiento transgénicas, estando el método caracterizado por pre-cultivar explantes de pimiento en medio de inducción del callo, seguido de co-cultivo con Agrobacterium.

Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona un método para producir en masa plantas de pimiento transgénicas, comprendiendo el método las etapas de: (a) pre-cultivar explantes de pimiento en un medio de inducción del callo; (b) co-cultivar los explantes pre-cultivados con Agrobacterium en los que se ha introducido un gen diana; (c) cultivar los explantes co-cultivados en un medio de selección a fin de formar un callo y seleccionar el callo formado; y (d) cortar el callo y cultivar el callo cortado en un medio de inducción de brotes con el fin de formar brotes.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "explantes" se refiere a segmentos de tejido extirpados de plantas, que incluyen cotiledones o hipocótilos.

En lo que sigue se describirá en detalle la presente Invención.

El método de la presente invención comprende las siguientes etapas: (a) el precultivo de explantes de pimiento; (b) la transformación (co-cultivo con Agrobacterium en el que se ha introducido un gen diana), (c) la selección del callo; y (d) la formación de brotes. Además, el método de la invención puede comprender adlclonalmente las etapas de formación de la raíz y la adaptación al suelo. En particular, el método de la invención se caracteriza por que los explantes de pimiento se pre-cultlvan en un medio de inducción del callo y se transforman con el fin de formar artificialmente el callo, y la regeneración de plantas se induce a partir del callo formado. Se describirá ahora en detalle cada una de las etapas del método de la Invención.

(a) Pre-cultivo de explantes para la Inducción del callo

En el método de la invención, explantes de pimiento se pre-cultivan primero en medio de inducción del callo. En este momento, los explantes son dañados preferiblemente con el fin de fomentar la inducción del callo. Además, como explantes de pimiento, se pueden utilizar en la presente invención cotiledones o hipocótllos. Se utilizan con mayor preferencia los cotiledones obtenidos mediante la esterilización y el lavado de semillas de pimiento y la germinación de las semillas lavadas en medio MS.

El medio de inducción del callo que se utiliza en la etapa de pre-cultivo del método de la invención se refiere a un medio de cultivo vegetal (por ejemplo, medio MS y medio 1/4 MS) que contiene una hormona vegetal que induce el callo. La hormona vegetal que se puede utilizar para la inducción del callo es una seleccionada del grupo que consiste en zeatina, ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D), ácido indol-3-acético (IAA), ácido naftaleno-acético (NAA ) y bencilaminopurina (BA).

Cada una de las hormonas vegetales se añade en la siguiente concentración: ,1-5 mg/l de 2,4-D, ,1-5 mg/l de IAA, ,1-5 mg/l de zeatina, ,1-5 mg/l de NAA y ,1-5 mg/l de BA. Lo más preferiblemente, se puede utilizar 1 mg/l de 2,4-D o 1 mg/l de IAA. También se puede utilizar una mezcla de las hormonas antes mencionadas. Preferiblemente, se puede utilizar una mezcla de ,1-2 mg/l de zeatina con uno seleccionado del grupo que consiste en ,1-5 mg/l de 2,4-D, ,1-5 mg/l de IAA y ,1-2 mg/l de NAA. La etapa de pre-cultivo se realiza preferiblemente a 22-28° C durante 2-6 horas Durante la etapa de pre-cultivo, el callo es induce en las partes dañadas de los explantes por la Influencia de la hormona.

(b) Transformación (co-cultivo con Agrobacterium en el que se ha introducido un gen diana)

Con el fin de transformar los explantes que han sido pre-cultivados en el medio de inducción del callo, los explantes pre-cultivados se co-cultivan con Agrobacterium. Antes del co-cultivo, un gen diana a ser introducido en plantas de pimiento necesita ser introducido en Agrobacterium. La transformación de Agrobacterium puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar el método de congelación- descongelación (Glevin et al., Ptant molecular biology. Kluwer Academic Publishers A3/7, 1988). Después de ello, Agrobacterium, en el que se ha introducido el gen diana, se inocula a los explantes de pimiento pre-cultivados durante 1-2 minutos y luego se co-cultiva. En este momento, el mismo medio que el medio de inducción del callo utilizado en la etapa (a) se utiliza preferiblemente como medio de co-cultivo. Además de ello, la etapa de cocultivo se realiza preferiblemente a 22-28°C durante 4-8 horas.

(c) Selección del callo

Los explantes de pimiento que han sido co-cultivados con Agrobacterium se cultivan en medio de selección para seleccionar el callo transgénico. El medio de selección contiene preferiblemente no sólo un antibiótico para la selección del callo transgénico, sino también zeatina y IAA para la inducción del desarrollo del callo. Como sustituto para IAA, también se puede utilizar NAA. Además, el antibiótico utilizado en la selección del callo es preferiblemente un antibiótico correspondiente a un gen resistente a los antibióticos presente en un vector recombinante introducido en Agrobacterium. También, zeatina se utiliza preferiblemente a una concentración de ,1-5 mg/l, cada uno de IAA y NAA se utiliza preferiblemente a una concentración de ,1-1 mg/l. Más preferiblemente, se puede utilizar una mezcla de 2 mg/l de zeatina y ,3 mg/l de IAA. 4-5 semanas después de que los explantes... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir plantas de pimiento transgénicas, comprendiendo el método las etapas de:

(a) pre-cultlvar explantes de pepino en un medio de Inducción del callo;

(b) co-cultivar los explantes pre-cultivados con Agrobacterium en el que se ha Introducido un gen diana;

(c) cultivar los explantes co-cultivados en un medio de selección con el fin de formar un callo y seleccionar el callo formado; y

(d) cortar el callo y cultivar el callo cortado en un medio de inducción de brotes con el fin de formar brotes.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los explantes de la etapa (a) se dañan con el fin de fomentar la inducción del callo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los explantes de la etapa (a) son cotiledones o hlpocótllos.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de inducción del callo de la etapa (a) comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en zeatlna, ácido 2,4-diclorofenoxiacétlco (2,4-D), ácido indol-3-acético (IAA), ácido naftalenoacético (NAA) y bencilaminopurina (BA).

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el medio de inducción del callo de la etapa (a) comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en ,1-5 mg/l de 2,4-D, ,1-5 mg/l de IAA, ,1-5 mg/l de zeatina, ,1-5 mg/l de NAA y ,1-5 mg/l de BA.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el medio comprende 1 mg/l de 2,4-D o 1 mg/l de IAA.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el medio comprende una mezcla de ,1-2 mg/l de zeatina con uno seleccionado del grupo que consiste en ,1-5 mg/l de 2,4-D, ,1-5 mg/l de IAA y ,1-2 mg/l de NAA.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el co-cultivo en la etapa (b) se realiza en el mismo medio que el medio de inducción del callo utilizado en la etapa (a).

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de selección en la etapa (c) comprende una mezcla de ,1 ~5 mg/l de zeatina y ,1 ~1 mg/l de IAA o una mezcla de ,1-5 mg/l de zeatina y ,1-1 mg/l de NAA.

1. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de inducción de brotes en la etapa (d) comprende uno seleccionado del grupo que consiste en:

(i) ,5-1 mg/l de zeatina;

(¡i) una mezcla de ,5-1 mg/l de zeatina y ,1-,2 mg/l de IAA; y (iii) una mezcla de ,5-1 mg/l de zeatina y ,1-,2 mg/l de NAA.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que después de la etapa (d) está comprendida adicionalmente la siguiente etapa (e): transferir los brotes a un medio de formación de raíces, y luego cultivar los brotes transferidos para formar raíces.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen diana es un gen implicado en mecanismos de defensa de la planta o un gen implicado en la biosíntesis de metabolitos útiles.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen implicado en mecanismos de defensa de la planta es un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína inactivadora de ribosomas (RIP), ácido jasmónico carboxilo metiltransferasa, trehalosa sintasa, defensina 1.2 de plantas, tionina sintasa, glucanasa, quitinasa, fenilalanina amonio liasa, chalcona sintasa, glutatión-S-transferasa, antranilato sintasa, proteína de almacenamiento, calmodulina, triptófano sintetasa, inhibidor de proteinasa II, óxido nítrico sintasa, cistemina, ácido graso peroxidasa, aleño óxido sintasa, factor de transcripción 1 de la interacción pimiento-PMMV (PPI1), factor de transcripción de dominio WRKY, proteína de respuesta a patógenos y proteína de la envuelta del virus.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el gen que codifica la proteína de la envuelta del virus

se selecciona del grupo que consiste en el gen TMV-CP, CMV-CP y PepMoV-CP

15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen implicado en la biosíntesis de metabolitos útiles se selecciona del grupo que consiste en genes implicados en la biosíntesis de taninos, sinapina, saponina,

alicina, espinosina, ácido cinámico, flavonoldes, terpenoides, catequina, vitaminas, penicilina, indol, insulina, prostaglandlnas, taxol, alisol, ricina, cartenoide y capsisina.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pimiento es el género Capsicum.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho género Capsicum es Capsicum annuum L.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho Capsicum annuum L se selecciona del grupo que consiste en pimiento guindilla (Capsicum annuum L. var. acuminatum), pimiento dulce o campana (Capsicum annuum L. var. grossum), pimiento cónico (Capsicum annuum L. var. conoides), pimiento cereza (Capsicum 15 annuum L. var. cerasiforme), pimiento rojo de racimo (Capsicum annuum L. var. fasciculatum) y pimiento largo (Capsicum annuum L. var. longum).