Método inmunológico para detectar infección por JC activa.

Método de detección de infección activa extrarrenal por virus JC,

particularmente en el sistema nervioso central de un paciente candidato para un tratamiento inmunosupresor, que comprende la etapa de:

a) examinar la presencia de linfocitos T activados frente al virus JC en una muestra de sangre de dicho paciente, mediante la exposición de dicha muestra de sangre a epítopos del virus durante hasta 48 horas.

Método inmunológico para detectar infección por JC activa La invención se refiere a un método inmunológico para detectar una infección activa extrarrenal por el virus JC en un paciente candidato para un tratamiento con un tratamiento inmunosupresor o durante el transcurso de este tratamiento.

El uso creciente de anticuerpos monoclonales (AcM) usados para la inmunomodulación terapéutica en enfermedades autoinmunitarias está asociado con un aumento del riesgo de contraer de infecciones oportunistas, algunas de las cuales pueden ser potencialmente mortales.

Esto es particularmente cierto para la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP) , cuyo agente causante, el poliomavirus JC (o VJC) puede, en determinadas condiciones de inmunosupresión local o sistémica, infectar activamente y destruir oligodendrocitos y astrocitos, conduciendo a zonas multifocales de desmielinización y grave disfunción neurológica asociada.

Se han notificado casos de LMP durante el transcurso del tratamiento de lupus con rituximab o psoriasis con efalizumab pero particularmente tras el tratamiento de esclerosis múltiple (EM) y enfermedad de Crohn tratadas con natalizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra la integrina α4/β1 (VLA-4) .

El principal efecto secundario observado durante el tratamiento con natalizumab es la aparición de LMP, que se ha observado con una incidencia estimada de 1 por 1000 (Kappos L et al. 2007 Lancet Neurol. 6:431-41) .

También se ha observado la aparición de LMP en pacientes tratados con efalizumab durante más de 3 años, y ha conducido a la suspensión de la autorización de comercialización de este AcM en Europa.

Un periodo de exposición prologada a AcM, una exposición previa a terapia inmunosupresora, una inmunodeficiencia (tal como una reducción de células T CD4) son probablemente factores contribuyentes, pero estos factores no están presentes necesariamente. Existen otros factores de riesgo, tal como factores genéticos relacionados con el huésped o el nivel de infección preexistente con el virus JC.

Por tanto, es importante poder identificar los sujetos en los que la exposición a AcM está asociada con un aumento del riesgo de desarrollar LMP. Esto mejoraría la seguridad de tal AcM. También es importante monitorizar pacientes tratados con AcM para determinar cualquier infección activa por el virus JC en el sistema nervioso central en un estadio temprano, para poder detener el tratamiento con AcM antes de la aparición de LMP y lesiones neurológicas irreversibles.

Desgraciadamente, poco hay que esperar de marcadores tales como ADN del virus JC en orina detectada mediante 40 PCR) o la presencia de anticuerpos contra el virus JC en suero.

En efecto, el virus JC infecta a una mayoría de la población adulta con una replicación activa en células epiteliales renales asociadas con la excreción urinaria en una proporción sustancial de individuos infectados. La replicación activa del virus JC parece tolerarse en el riñón, por motivos que siguen sin determinarse (y no conduce 45 necesariamente a generación de respuesta de células T efectoras detectable) , pero no en tejidos extrarrenales y en particular en el SNC. Fuera del riñón, la detección de este virus es poco común en pacientes inmunocompetentes. En particular, la detección del virus en el líquido cefalorraquídeo tiene una especificidad muy alta con respecto al diagnóstico de LMP.

En una serie de adultos sanos con el virus JC, no se detectó respuesta efectora de células T CD8 frente al virus JC en la sangre. Sin embargo, se detectó este tipo de respuesta en el 67% en una cohorte de pacientes infectados por VIH con LMP. En caso de grave inmunodepresión, puede aumentar el riesgo de una replicación viral significativa en el SNC posteriormente a la disminución de la presión inmunitaria sobre los virus preexistentes en el SNC o a la invasión del SNC desde reservorios periféricos.

Gasnault et al. (AIDS 17, 2003, 1443-49) describen una prueba de proliferación de células T tras la activación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con VJC purificado durante 7 días. Esta prueba hace posible detectar células T CD4 de memoria centrales, que secretan IL-2, y proporcionan ayuda a las células T CD8, tras la reactivación de antígeno. Esta prueba es de particular interés en pacientes con VIH, ya que estos pacientes 60 presentan una reducción de células T de memoria centrales CD4 y una pérdida de respuestas proliferativas de células T frente a antígenos de recuerdo tales como tuberculina, citomegalovirus, candidina (de Candida albicans) y similares. Esta prueba detecta células de memoria centrales incluyendo células quiescentes, cuya presencia señala a un contacto con VJC. Esto puede representar una infección antigua, una infección reciente o una infección en curso. En este artículo, se usa la detección del virus JC en orina como marcador de la susceptibilidad a la infección, 65 en ausencia de pruebas serológicas que puedan utilizarse.

Khalili et al (Neurology 68, 2007, 985-90) describen el estado de la técnica con relación a VJC y el desarrollo de LMP. Los autores describen en particular las relaciones entre VJC y el sistema inmunitario. Este documento que una respuesta inmunitaria celular, en particular de linfocitos T citotóxicos, es importante para controlar el virus. En el párrafo relacionado con los métodos de detección de VJC, los autores sólo citan la detección de la carga viral mediante PCR en la muestra del paciente.

Weber et al (Ann Neurol 49, 2001, 636-42) estudiaron la respuesta humoral y celular frente a LMP en pacientes negativos o positivos para VIH que tienen LMP o no. Se ha estudiado la proliferación de PBMC y su capacidad para producir interferón gamma e IL-10 tras la estimulación con partículas pseudovirales de VJC, que expresan la proteína VP1. Los autores indican claramente que no existe ninguna correlación entre la proliferación de PBMC o la producción de citocinas y la presencia de ADN de VJC en PBMC (página 640, columna derecha) . Además, la proliferación de PBMC es menor en pacientes con LMP que en pacientes no infectados. Se observa proliferación de las PBMC tras la sensibilización con el antígeno durante 4 días (página 638, columna izquierda) , de modo que Weber et al investigan las células T de memoria centrales CD4.

Petrovsky y Harrison (J Immunol Methods. 186, 1995, 37-46) describen un ensayo para detectar células T activadas en sangre, mediante la medición de citocinas en sangre completa.

Natalizumab, a través de su unión a VLA-4, bloquea el tráfico de linfocitos T activados (ya sean autorreactivos o estén dirigidos contra agentes infecciosos) ) desde el sistema nervioso periférico al central. Sin embargo, el efecto de este anticuerpo sobre la activación periférica de estas células, a través de células dendríticas que presentan antígenos del SNC, y que circulan desde el parénquima cerebral hasta los ganglios linfáticos cervicales, no se determina claramente y se postula que la actividad viral en el SNC puede identificarse indirectamente en la periferia a través de la detección de respuestas de células T efectoras específicas del virus JC.

Por tanto, la invención se refiere a un método de detección de infección extrarrenal por el virus JC, particularmente en el sistema nervioso central de un paciente candidato para un tratamiento inmunosupresor, que comprende la etapa de:

a) examinar la presencia de linfocitos T activados (efectores) frente al virus JC en una muestra de sangre de dicho paciente, mediante la exposición de dicha muestra de sangre a epítopos del virus durante hasta 48 horas.

En efecto, la presencia de tales linfocitos T activados indicará infección por el virus JC en el sistema nervioso central.

En el contexto de la presente divulgación, un tratamiento inmunosupresor consiste en la administración de una sustancia que reducirá el número, la actividad o el tráfico de células del sistema inmunitario.

En particular, un tratamiento inmunosupresor es de particular interés para pacientes que tienen una enfermedad autoinmunitaria, tal como psoriasis, lupus, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o esclerosis múltiple.

Tales sustancias que pueden utilizarse en un tratamiento inmunosupresor incluyen:

- Agentes citostáticos (tales como mostazas nitrogenadas (ciclofosfamida) , nitrosoureas, compuestos de platino, 45 análogos de ácido fólico, tales como metotrexato, análogos de purina tales como azatioprina y mercaptopurina, análogos de pirimidina, inhibidores de la síntesis de proteínas o antibióticos citotóxicos tales como dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de infección activa extrarrenal por virus JC, particularmente en el sistema nervioso central de un paciente candidato para un tratamiento inmunosupresor, que comprende la etapa de:

a) examinar la presencia de linfocitos T activados frente al virus JC en una muestra de sangre de dicho paciente, mediante la exposición de dicha muestra de sangre a epítopos del virus durante hasta 48 horas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se realiza dicho examen mediante detección de producción de al menos una citocina inflamatoria por dichos linfocitos T tras la presentación de epítopos del virus JC a dichos linfocitos.

3. Método según la reivindicación 2, en el que se presentan que dichos epítopos a dichos linfocitos mediante la exposición de dichos linfocitos a virus JC purificado. 15

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dicha citocina está comprendida en el grupo que consiste en interferón gamma e interleucina 2.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que se detecta dicha citocina mediante ELISA, 20 ELISPOT o citometría de flujo.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se realiza dicho examen directamente en dicha muestra de sangre completa.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se realiza dicho examen en monocitos de sangre periférica aislados o linfocitos T aislados de dicha muestra de sangre.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se expone dicha muestra de sangre a epítopos del virus entre 12 y 36 horas. 30

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además la etapa de:

b) examinar o cuantificar la presencia del virus JC en una muestra de líquido cefalorraquídeo de dicho paciente.

10. Método según la reivindicación 9, en el que se realiza la etapa b) mediante PCR o ensayo de PCR cuantitativo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho tratamiento inmunosupresor comprende la administración de un anticuerpo monoclonal tal como natalizumab o efalizumab.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho paciente no había recibido dicho tratamiento inmunosupresor antes de la etapa a) .

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho paciente estaba recibiendo dicho tratamiento inmunosupresor antes de la etapa a) . 45

14. Método de monitorización del riesgo de infección con el virus JC durante el transcurso de un tratamiento inmunosupresor, que comprende la etapa de repetir regularmente el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, durante el transcurso de dicho tratamiento.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho paciente presenta un signo o síntoma de leucoencefalopatía multifocal progresiva.