Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol.

Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol,

caracterizado por reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-1, Gpd1, y reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-2, Gpd2,

por reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd1 y eliminar la actividad de la proteína Gpd2; o por eliminar la actividad de la proteína Gpd1 y reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd2; o por reducir, pero no eliminar, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 se consigue reduciendo la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2,

caracterizado porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.

Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol

La invención se refiere a un método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol, a una célula de levadura modificada y a un uso de la misma para producir etanol. La invención se refiere además a un método para producir etanol a partir de biomasa.

El bioetanol es una alternativa prometedora a los combustibles fósiles. El creciente interés por los biocombustibles renovables resulta principalmente del hecho de que los combustibles fósiles en el mundo son limitados. Además, existe la tendencia a disminuir la dependencia de la importación de petróleo. La Comisión Europea ha planeado sustituir progresivamente el 20% de los combustibles fósiles convencionales por combustibles alternativos en el sector del transporte para el 2020 (el 5, 75% para el 2010) . Una ruta técnica es producir bioetanol mediante fermentación microbiana a partir de diversos cultivos domésticos (biomasa) .

En Brasil y en los Estados Unidos es común la producción de bioetanol a partir de biomasa que contiene azúcar y almidón. La levadura Saccharomyces (S.) cerevisiae se ha usado tradicionalmente en este procedimiento. De hecho, la levadura S. cerevisiae tiene propiedades excepcionales para la producción de bioetanol. En particular, su alta tolerancia a las condiciones que se producen durante la producción de etanol industrial apenas permitirá que otros microorganismos desplacen a la levadura en este campo.

S. cerevisiae forma glicerol como subproducto durante el catabolismo de glucosa además de los productos de fermentación principales: etanol, dióxido de carbono y biomasa. El flujo de carbono hacia glicerol es bastante sustancial y puede ascender a hasta 0, 1 g de glicerol por gramo de glucosa (Alfenore et al., 2004; Aldiguier et al., 2004) .

La biosíntesis de glicerol a partir del producto intermedio glicolítico dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en S. cerevisiae se realiza mediante dos etapas enzimáticas catalizadas por la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPDH) y la glicerol 3-fosfatasa (GPP) (véase también la figura 1) . Cada enzima se codifica por dos isogenes GPD1/GPD2 y GPP1/GPP2, respectivamente.

La biosíntesis de glicerol tiene papeles esenciales en S. cerevisiae. Una de las funciones más importantes es mantener un equilibrio redox citosólico, especialmente en condiciones anaerobias, y probablemente también en condiciones aerobias cuando la concentración de azúcar es alta (efecto Crabtree) (Ansell et al., 1997; Bakker et al., 2001; Rigoulet et al., 2004; Valadi et al., 2004) . La ruta de biosíntesis de glicerol también está implicada en la biosíntesis de glicerofosfolípidos y triacilgliceroles que se forman a partir de L-glicerol 3-fosfato (Kohlwein et al., 1996; Mullner y Daum, 2004) . Además, el glicerol intracelular está implicado en osmoadaptación (Hohmann, 2002) , protección frente a estrés oxidativo (Pahlman et al., 2001) y respuesta a choque térmico (Siderius et al., 2000) . Respuestas a elevadas temperaturas y alta osmolaridad implican varias rutas de señalización incluyendo la ruta de proteína cinasa C y la ruta de HOG, que regulan los niveles intracelulares de glicerol (Hohmann, 2002; Wojda et al., 2003) .

En teoría, la redirección del flujo de carbono en S. cerevisiae hacia la ruta de síntesis de etanol eliminando la formación de glicerol podría aumentar el rendimiento de etanol en al menos un 10%. Además, una reducción del glicerol en el caldo de fermentación conduciría a una disminución en los costes de extracción de etanol, puesto que el glicerol ha provocado problemas en las unidades de destilación y procedimientos de separación tras la fase de fermentación. Además, se reducirían los volúmenes de residuos. Sin embargo, desde el punto de vista de los aspectos prácticos, reducir la formación de glicerol sin afectar negativamente a la aptitud biológica de las células es extremadamente desafiante debido a las diversas funciones biológicas de la ruta de biosíntesis de glicerol, tal como se explicará resumidamente ahora con referencia a estudios anteriores.

Hace pocos años, se notificó el primer enfoque de ingeniería metabólica para reducir el glicerol (Nissen et al., 2000a) . Se aumentó el rendimiento de etanol en fermentaciones discontinuas aerobias en un 12% cuando la formación de glicerol se suprimió completamente mediante la deleción de GPD1 y GPD2. El crecimiento de este mutante doble se veía gravemente afectado incluso en presencia de oxígeno. Por tanto, la productividad volumétrica de etanol obtenida con este enfoque distaba mucho de tener relevancia industrial. El hecho de que el crecimiento del mutante doble gpd1 gpd2 se viese afectado considerablemente, se ha explicado por una capacidad limitada de reoxidación de NADH respiratoria (mediante las NADH deshidrogenasas externas Nde1p, Nde2p y el transportador L-G3P/DHAP mitocondrial) (Nissen et al., 2000a) que son las únicas rutas para reoxidar el exceso de NADH citosólico cuando GPD está ausente.

Otros intentos de reducir la formación de glicerol se basaron en la introducción de transhidrogenasas bacterianas en la levadura. Estos enfoques no funcionaron ya que, por un lado, la transhidrogenasa de Azotobacter vinelandii produjo el efecto opuesto al esperado (Nissen et al., 2001) , y por otro lado, la transhidrogenasa unida a membrana de Escherichia coli permaneció localizada en la membrana del retículo endoplásmico (Anderlund et al., 1999) .

Una estrategia bastante satisfactoria para mejorar el rendimiento de etanol ha sido la modificación mediante ingeniería metabólica de la asimilación de amonio, que reduce la producción de NADH durante la biosíntesis de

aminoácidos (Nissen et al., 2000b) . El rendimiento de glicerol se redujo en un 38% y el rendimiento de etanol aumentó en un 10%. Sin embargo, para una función apropiada, este enfoque requiere que la levadura utilice amonio como fuente de nitrógeno. Medios industriales contienen a menudo aminoácidos, un hecho que reducirá considerablemente el éxito de este enfoque en condiciones industriales pertinentes.

Recientemente, se llevó a cabo un estudio in silico usando un modelo metabólico de S. cerevisiae a escala de genoma con el fin de evaluar posibles estrategias de ingeniería metabólica para mejorar el rendimiento de etanol en S. cerevisiae (Bro et al., 2005) . Estos enfoques se han diseñado para impedir la producción de NADH en exceso a través de síntesis de biomasa, y por tanto, reducir la necesidad de producir glicerol. Basándose en las predicciones de los autores, varios enfoques deberían aumentar el rendimiento de etanol en hasta un 10, 4%. Se sometió a prueba in vivo una de las estrategias predichas, pero a diferencia de la teoría, sólo dio como resultado un aumento del 3% del rendimiento de etanol.

Lin H. et al. han descrito el papel de fosfolipasa C para la expresión de Gpd 1 en Saccharomyces cerevisiae (Lin et al., 2002) .

Por tanto, los enfoques de ingeniería metabólica mencionados anteriormente no tienen o sólo tienen un impacto mínimo sobre la productividad de etanol en condiciones pertinentes a nivel industrial debido a las limitaciones en el rendimiento de etanol, crecimiento o dependencia del medio. Además, sigue siendo cuestionable si los enfoques actuales y predichos demostrarían ser satisfactorios a un estrés térmico y de etanol elevado de fermentaciones industriales, puesto que no tienen en cuenta la necesidad de las células de glicerol intracelular.

Descripción de la invención Por tanto, el problema subyacente de la presente invención era aumentar el rendimiento de conversión de constituyentes de biomasa que puede fermentarse para dar etanol mediante levadura y, de hecho, aumentar la rentabilidad de plantas de bioetanol. Una manera de lograr este objetivo es reducir la producción del subproducto glicerol.

Un desafío particular en la resolución de este problema radica en el hecho de que se ha demostrado que la eliminación completa de la formación de glicerol no es satisfactoria, puesto que la ruta de biosíntesis de glicerol tiene varias funciones importantes para el crecimiento celular y la tolerancia al estrés.

En su lugar, los inventores encontraron sorprendentemente una estrategia para modificar una célula de levadura silvestre que conduce a un rendimiento aumentado de etanol a partir de azúcares, es decir azúcares que pueden fermentarse presentes en hidrolizados de biomasa vegetal, pero que al mismo tiempo no tiene una influencia negativa sobre la velocidad de crecimiento de las células de levadura o el rendimiento de biomasa. Según la invención, esto se consigue reduciendo (pero no... [Seguir leyendo]

1. Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol, caracterizado por reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-1, Gpd1, y reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-2, Gpd2,

por reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd1 y eliminar la actividad de la proteína Gpd2; o por eliminar la actividad de la proteína Gpd1 y reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd2; o por reducir, pero no eliminar, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 se consigue reduciendo la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2, 10 caracterizado porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el gen GPD1 y/o el gen GPD2 se expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPD1 o al gen GPD2, en el que el promotor provoca menos de o igual al 20% de transcripción del promotor TEF1 ligado de manera funcional al gen GPD1 o al gen GPD2.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5

o SEQ ID NO 6.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por reducir adicionalmente la actividad de la proteína glicerol 3-fosfatasa-1, Gpp1, y/o la proteína glicerol 3-fosfatasa-2, Gpp2, 20 y por reducir la actividad de la proteína Gpp1 y eliminar la actividad de la Gpp2, o por eliminar la actividad de la proteína Gpp1 y reducir la actividad de la Gpp2, o por reducir la actividad de la proteína Gpp1 y reducir la actividad de la Gpp2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpp1 y/o la proteína Gpp2 se consigue reduciendo la expresión de la proteína Gpp1 y/o la Gpp2,

caracterizado porque la expresión del gen GPP1 y/o el gen GPP2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el gen GPP1 y/o el gen GPP2 se expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPP1 o al gen GPP2, en el que el promotor provoca menos de o igual al 20% de transcripción del promotor TEF1 ligado de manera funcional al gen GPP1 o al gen GPP2.

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5

o SEQ ID NO 6.

7. Célula de levadura modificada, en la que la actividad de la proteína Gpd1 y Gpd2 se reduce en comparación con una célula de levadura silvestre, 35 en la que se reduce, pero no se elimina, la actividad de la proteína Gpd1 y se elimina la actividad de la proteína Gpd2; o se elimina la actividad de la proteína Gpd1 y se reduce, pero no se elimina, la actividad de la proteína Gpd2; o se reduce, pero no se elimina, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, 40 en la que la actividad reducida se consigue mediante una expresión reducida del gen GPD1 y/o gen GPD2, caracterizada porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión del gen silvestre.

8. Célula de levadura modificada según la reivindicación 7, caracterizada porque el gen GPD1 y/o el GPD2 se expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPD1 o al gen GPD2, en la que 45 el promotor es débil en comparación con el promotor en la célula de levadura silvestre.

9. Célula de levadura modificada según la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 6.

10. Uso de una célula de levadura modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para producir etanol.

11. Método para la producción de etanol, que comprende las siguientes etapas: -proporcionar una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, -proporcionar biomasa, -hacer crecer la célula de levadura en presencia de la biomasa en condiciones que permiten la producción de etanol. 10