Método de detección de microorganismos.

Método de determinación del origen de un gen CMY-2 llevado por una bacteria,

en una muestra, caracterizado porque comprende la etapa de búsqueda de la naturaleza de los nucleótidos 373 y 437 en dicho gen CMY-2, un gen CMY-2 de origen plasmídico que presenta una citosina (resp una guanina) en posición 373 (resp 5 437), un gen CMY- 2 de origen cromosómico que presenta una adenosina (resp una citosina), estando las posiciones determinadas respecto de SEC ID N.º: 1.

Método de detección de microorganismos

La invención se refiere al ámbito del diagnóstico y a la detección de bacterias resistentes a los antibióticos en una muestra.

La actividad de los antibióticos tiende a reducirse a lo largo del tiempo debido a la aparición y a difusión de mecanismos de resistencia bacteriana. Actualmente la comercialización de nuevas moléculas antibacterianas eficaces se ha ralentizado en gran medida, mientras que el uso extensivo en medicina humana y veterinaria de los antibióticos ha conducido a la difusión masiva y globalizada de los determinantes de la resistencia bacteriana.

Las p-lactaminas constituyen la familia de antibióticos más consumida en el mundo debido a su espectro de actividad antibacteriana amplio, su eficacia y su casi ausencia de efectos indeseables. Por consiguiente, los mecanismos de resistencia a estos antibióticos están ampliamente extendidos en el mundo bacteriano, especialmente entre las bacterias patógenas que son las enterobacterias.

El mecanismo de resistencia a las p-lactaminas más extendido entre las mismas es la producción de enzimas hidrolizantes denominadas p-lactamasas. Estas enzimas constituyen una familia muy heterogénea en términos de espectro de hidrólisis y de secuencia nucleotídica. Los genes que codifican estas enzimas están situados en el cromosoma de las bacterias o en elementos móviles como los plásmidos. Este soporte transmisible de bacteria a bacteria asegura al gen de resistencia una difusión importante. Si el origen de la mayoría de las p-lactamasas sigue siendo desconocido actualmente, se ha podido observar recientemente la movilización de genes de origen cromosómico sobre elementos móviles, entre ellos las cefalosporinasas plasmídicas.

Las cefalosporinasas tienen un espectro de hidrólisis amplio y el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias productoras de tales enzimas se limita a algunas moléculas (carbapenemas), cuya actividad puede verse comprometida en caso de existencia de otros mecanismos de resistencia.

La difusión de los genes de cefalosporinasas en las bacterias patógenas como Escherichia coli es un problema importante de Salud Pública, al mismo título que la difusión de las p-lactamasas de espectro ensanchado (BLSE). El único medio eficaz de luchar contra esta difusión en el seno de estructures de salud es detectar los pacientes portadores de bacterias productoras de tales enzimas y tomar las medidas de higiene y de confinamiento necesarias para limitar las transmisiones de paciente a paciente. La detección de bacterias multiresistentes en la flora nasal (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, o SARM) o digestiva (enterobacterias productoras de BLSE, enterococo resistente a la vancomicina, o ERV) es hoy en día una práctica rutinaria en numerosas estructuras de cuidados. Sin embargo, la mayoría de las bacterias productoras de cefalosporinasas plasmídicas no son reconocidas por estos métodos, dando lugar a la difusión invisible de estos genes.

Numerosos autores han propuesto diversos métodos fenotípicos para poner de manifiesto la producción de cefalosporinasas en el seno de cepas bacterianas (1, 3-11). Sin embargo, la posición cromosómica o plasmídica del gen de resistencia (capital en términos de impacto de difusión y por lo tanto en términos de medidas de higiene a aplicar) solo se puede determinar por métodos moleculares para las bacterias susceptibles de producir su propia cefalosporinasa cromosómica. En efecto las secuencias nucleotídicas son virtualmente idénticas entre los genes en posiciones plasmídicas y los genes cromosómicos. Así pues, si la bacteria «parental» se encuentra frecuentemente en la flora de los pacientes, el riesgo es de desembocar en un gran número de falsos positivos en cuanto a la detección de las cefalosporinasas plasmídicas.

Perez-Perez y Hanson (J Clin Microbiol. Junio de 22; 4(6): 2153-62) describen un procedimiento de determinación del origen plasmídico de un gen CMY-2 llevado por una bacteria que comprende una etapa de amplificación por PCR. Este procedimiento no permite distinguir entre el origen cromosómico o plasmídico del gen en presencia de una bacteria "parental" que tiene el mismo gen cromosómico {Citrobacter freundií).

La presente invención proporciona un método que permite detectar la presencia, en una muestra, de una bacteria que lleva un gen de cefalosporinasa de tipo CMY-2, en presencia o no de la bacteria «parental» Citrobacter freundii.

Esta detección es ahora posible por la puesta de manifiesto por los autores de la invención que el gen CMY-2 de origen plasmídico presenta una citosina (resp una guanina) en posición 373 (resp 437), el gen de origen cromosómico que presenta una adenosina (resp. una citosina).

El método de la invención permite de este modo diferenciar y caracterizar la localización (plasmídica o cromosómica) del gen CMY-2: el análisis específico de ambos nucleótidos mencionados anteriormente permite discriminar las cepas que llevan el gen concreto en posición plasmídica de las que lo llevan en posición cromosómica.

La invención se refiere de este modo a un método de detección de la presencia de al menos una bacteria resistente

a las p-lactaminas en una muestra y portadora de un gen CMY-2 plasmídico, caracterizado porque comprende la etapa de detección de la presencia de una molécula de ADN en dicha muestra, cuya secuencia presenta al menos el 9% de identidad, preferiblemente al menos el 95%, de manera más preferida al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad con SEC ID N.2: 1 y cuyos nucleótidos 373 y 437 son respectivamente una citosina y una guanina.

SEC ID N.2: 1 representa de este modo un alelo plasmídico del gen CMY-2. Su secuencia puede variar debido a la diversidad genética. SEC ID N.2: 1 corresponde al acceso GenBank AM779745, correspondiente al gen blaCMY-2 para la beta-lactamasa CMY-2, aislado del plásmido pta de Escherichia coli.

Otros genes plasmídicos CMY-2 están asimismo disponibles en las bases de datos, con diversos números de acceso.

La presencia de estos dos nucleótidos (C373 y G437) en el gen CMY-2 es indicativa de la naturaleza plasmídica del gen. En efecto, los genes de origen cromosómico presentan respectivamente una adenosina y una citosina.

La consecuencia de estas mutaciones es la presencia de una arginina en posición 125 o 146 en las proteínas expresadas por el gen plasmídico, expresando los genes de origen cromosómico una proteína que comprende una serina en posición 125 y una treonina en posición 146.

Cabe señalar que el método según la invención permite teóricamente detectar la presencia de una única bacteria que contiene un CMY-2 plasmídico en la muestra (con condiciones de amplificación satisfactorias).

Ahora bien, el método según la invención no permite determinar si las bacterias portadoras del gen CMY-2 plasmídico son todas del mismo género o si existen diferentes géneros de bacterias que contienen el plásmido en la muestra. Son necesarias pruebas complementarias para precisar este punto y caracterizar la naturaleza de la bacteria portadora de la resistencia.

La muestra puede ser de cualquier tipo. Puede tratarse de una muestra biológica que ha sido extraída previamente de un paciente. Tal muestra puede ser, sin que esta lista sea exhaustiva, una muestra de saliva, una muestra de orina, fecal, sanguínea, o procedente de una biopsia, especialmente de una biopsia intestinal.

El método puede asimismo ser aplicado sobre una extracción realizada en una muestra alimentaria, en una superficie o en un utensilio, especialmente utilizable en medio hospitalario (verificación de la asepsia de la superficie o del utensilio).

El método según la invención permite de este modo determinar la presencia de bacterias que contienen un gen CMY-2 de origen plasmídico, incluso cuando la muestra contiene bacterias del género Citrobacter freundii.

En efecto, es efectivamente probable que el gen CMY-2 plasmídico sea derivado del gen cromosómico AmpC de C. freundii (2). Este gen AmpC presenta una secuencia cercana a SEC ID N.2:1 (identidad superior al 8 % con SEC ID N.2: 1 y que puede ser superior al 9 % para ciertos alelos), pero cuyos nucleótidos 373 y 437 son respectivamente una adenosina y una citosina. Cabe señalar que la variabilidad existente entre los diferentes genes cromosómicos es más importante que la existente entre los diferentes genes plasmídicos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima, en una ventana de comparación.

En este marco de la presente invención, se alinean de... [Seguir leyendo]

1.- Método de determinación del origen de un gen CMY-2 llevado por una bacteria, en una muestra, caracterizado porque comprende la etapa de búsqueda de la naturaleza de los nucleótidos 373 y 437 en dicho gen CMY-2, un gen

CMY-2 de origen plasmídico que presenta una citosina (resp una guanina) en posición 373 (resp 437), un gen CMY-

2 de origen cromosómico que presenta una adenosina (resp una citosina), estando las posiciones determinadas respecto de SEC ID N.2: 1.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha muestra contiene bacterias del género Citrobacter 1 freundii.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque comprende una etapa de amplificación del ADN presente en dicha muestra.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende una etapa de hibridación del

ADN con una sonda específica de una u otra mutación.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha sonda está fijada a un soporte sólido.

6. Kit para la detección de la presencia de una bacteria resistente a las p-lactaminas y portadora de un gen CMY-2

plasmídico, en una muestra, que comprende instrucciones para la aplicación de un método según una de las reivindicaciones 1 a 5, así como una sonda que permite identificar la presencia de una citosina en posición 373 y/o de una guanina en posición 437, estando las posiciones determinadas respecto de SEC ID N.2: 1, conteniendo dicho kit asimismo iniciadores que permiten amplificar el gen CMY-2.