Medio de cultivo y de identificación específica de diferentes especies de Candida y procedimientos de análisis.

Medio de cultivo para la identificación específica y/o la diferenciación de las levaduras Candida albicans yCandida tropicalis,

caracterizado porque comprende dos sustratos:

- un primer sustrato, cromógeno o fluorígeno, constituido por una parte marcador y por una parte susceptiblede ser hidrolizada por una enzima del grupo de las hexosaminidasas, y

- un segundo sustrato, cromógeno o fluorígeno, constituido por una parte marcador y por una parte susceptiblede ser hidrolizada por una enzima del grupo de las glucosidasas.

siendo dicha parte marcador del segundo sustrato diferente de la parte marcador del primer sustrato.

Medio de cultivo y de identificación específica de diferentes especies de Candida y procedimientos de análisis.

La presente invención se refiere a un medio de cultivo y de identificación específica de levaduras y a un procedimiento de análisis microbiológico para identificar específicamente las levaduras Candida albicans y Candida tropicalis y/o para diferenciar las levaduras C. albicans y C. tropicalis, tal como se define en su alcance más amplio por las reivindicaciones adjuntas.

La especie C. albicans es la más comúnmente aislada a partir de muestras clínicas, y provoca infecciones más o menos importantes de la piel, de las uñas y de las mucosas, en los individuos que presentan defensas inmunitarias normales, e infecciones muy serias, en los individuos debilitados y, en particular, en aquéllos infectados por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) . Según los estudios, C. tropicalis es la segunda o la tercera especie en frecuencia de aislamiento, en las extracciones de origen humano. Es por lo tanto esencial, no únicamente el poder detectar muy rápidamente la presencia de estas levaduras en las extracciones sino también, asimismo, el diferenciar aquéllas que pertenecen a la especie C. albicans, de aquéllas de la especie C. tropicalis.

Para realizar este cometido, se han propuesto, en estos últimos años, numerosas técnicas para identificar rápidamente las levaduras C. albicans. El número más grande de entre éstas, se basa en la evidenciación de una actividad hexosaminidasa, es decir, de enzimas que tienen una actividad N-acetil-β-D-galactosaminidasa o N-acetilβ-manosaminidasa (FR-2 684 110, FR-2 659 982) . No obstante, estos procedimientos sufren de una especificidad reducida con respecto a las levaduras de la especie C. tropicalis.

Los inventores de la presente invención han descubierto que, procediendo a inhibir una actividad enzimática de la especie C. tropicalis, en particular la actividad hexosaminidasa, es posible el paliar los inconvenientes de los ensayos anteriormente citados, y con ello el aportar un medio de identificación y/o de diferenciación de las levaduras, en particular de C. albicans y de C. tropicalis, rápido y poco costoso.

Además, la actividad enzimática glucosidasa ha sido ya objeto de investigaciones por parte de ciertos documentos, como el de Casal, M. y Linares, M.J. "Contribution to the study of the enzymatic profiles of yeast organismes with medical interest", Mycopathologie 81, 155 - 159 (1983) . Esta actividad, es positiva en algunas cepas de C. albicans,

C. tropicalis y Candida pseudotropicalis (denominada, hoy día, Candida Kefyr) , pero negativa, para otras Candida, como por ejemplo, las C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei.

Ha parecido por lo tanto interesante el intentar acumular, en un mismo medio, la posibilidad de investigar dos actividades enzimáticas diferentes, es decir, hexosaminidasa y glucosidasa. Se ha constatado el hecho de que, en los medios según la invención, este cúmulo permite diferenciar, de una forma más precisa a las C. albicans, con relación a las C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C. tropicalis, y con relación a las otras Candida, pero permite asimismo diferenciar a las C. guilliermondii, C. kefyr.; C. lusitaniae y/o C. tropicalis, con relación a las otras Candida.

Por supuesto, se prevé asociar, en un mismo medio, a los sustratos específicos de las actividades hexosaminidasa y glucosidasa que se investigan, un inhibidor, e incluso un activador de la actividad hexosaminidasa.

Se describe asimismo un medio de cultivo y de identificación específica de las levaduras, que comprende un sustrato cromógeno o fluorígeno, susceptible de poder hidrolizarse mediante una enzima del grupo de las hexosaminidasas, caracterizado porque el medio comprende, además, por lo menos un compuesto selectivamente inhibidor de la actividad hexosaminidasa de Candida tropicalis.

Gracias a la invención, el medio de cultivo, permite en particular la identificación específica de las levaduras de la especie C. albicans y/o C. tropicalis.

Según un modo de realización, el medio de cultivo, comprende, en calidad de compuesto selectivamente inhibidor, una amida de fórmula (I) :

R- (CO-NR'R") n (I)

en la que, en primer lugar, o bien R, R' y R" están constituidas las unas con respecto a las otras, por:

- un átomo de hidrógeno,

- una cadena de hidrocarburo, saturada o insaturada, alifática o cíclica, que comprende eventualmente por lo menos un heteroátomo,

- o bien cada una de las R y/o R' y/o R", forman conjuntamente una cadena de hidrocarburo cíclica, saturada o insaturada, que comprende eventualmente por lo menos un heteroátomo,

y, en segundo lugar, n es un número entero, superior o igual a 1.

Por una cadena de hidrocarburo que "comprende" por lo menos un heteroátomo, se entiende que la cadena de hidrocarburo puede estar sustituida mediante por lo menos un sustituyente tal como, en particular, -NH2, -COOH, -SH, y un átomo de halógeno y/o puede estar interrumpida mediante por lo menos un heteroátomo tal como, en particular, O, S y N.

Según una forma de realización, el medio de cultivo comprende, en calidad de compuesto selectivamente inhibidor, 10 una amida de fórmula (I) :

R- (CO-NR'R") n (I)

en la que, en primer lugar, o bien R, R' y R", están constituidas, de una forma independiente las unas con respecto a 15 las otras, por:

-un átomo de hidrógeno,

-una cadena de hidrocarburo, saturada o insaturada, alifática o cíclica, eventualmente interrumpida mediante 20 por lo menos un heteroátomo,

-o bien cada una de las R y/o R' y/o R", forman conjuntamente, una cadena de hidrocarburo, cíclica, saturada

o insaturada, que comprende eventualmente por lo menos un heteroátomo,

y, en segundo lugar, n es un número entero, superior o igual a 1.

Según otra forma de realización, el medio de cultivo comprende, en calidad de compuesto selectivamente inhibidor, una amida de fórmula (I) :

R- (CO-NR'R") n (I)

en la que, en primer lugar, o bien R, R' y R" están constituidas, de una forma independiente las unas con respecto a las otras, por:

- un átomo de hidrógeno,

-una cadena de hidrocarburo, alifática,

y, en segundo lugar, n es igual a 1 o 2.

Según una forma de realización, el compuesto selectivamente inhibidor, es una acetamida.

Según otra forma de realización de la invención, el medio de cultivo comprende un activador específico de la enzima hexosaminidasa de C. albicans.

Según una forma de realización preferida de la invención, el activador específico de la enzima hexosaminidasa es la N-acetil-glucosamina.

Según otra forma de realización, el medio de cultivo comprende una mezcla de compuestos selectivamente inhibidores.

Según una forma de realización, la mezcla de compuestos selectivamente inhibidores se encuentra constituida por acetamida y formamida.

Según una forma de realización preferida de la invención, el medio es líquido o gelificado. 55 Según una forma de realización, el medio de cultivo es gelificado y comprende, para 1 litro:

-peptonas o mezcla de peptonas 0, 01 - 40 g

-extracto de levadura 0, 01 - 40 g

-glucosa (fuente de carbono) 0 - 10g

-tampón fosfato (pH entre 5 y 8, 5) 2, 5 - 100 mM

- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-β-D-glucosaminida 20 - 600·10 -6 M

-acetamida 0, 01 - 20 g

-inhibidor de bacterias 0 - 20 g

-agar 11 - 20 g

Según otra forma de realización, el medio de cultivo gelificado o líquido descrito anteriormente, comprende además N-acetil-glucosamina a 1, 0 g/l.

Según otra forma de realización, el medio de cultivo gelificado o líquido descrito anteriormente, comprende además formamida a 0, 5 g/l.

Otro objeto de la presente invención, es un procedimiento de análisis microbiológico para identificar selectivamente las levaduras C. albicans y/o C. tropicalis y/o diferenciar las levaduras C. albicans y C. tropicalis, caracterizado porque se pone directamente la muestra a analizar en contacto con por lo menos un medio de identificación descrito anteriormente.

A dicho efecto, la presente invención se refiere a un medio para la detección y la identificación específica de lavaduras, caracterizada porque comprende dos sustratos, un primer sustrato, cromógeno o fluorígeno, susceptible de poder ser hidrolizado por una enzima del grupo de las hexosaminidasas, y un segundo sustrato, cromógeno o fluorígeno, susceptible de poder ser hidrolizado por una enzima del grupo de las glucosidasas.

1. Medio de cultivo para la identificación específica y/o la diferenciación de las levaduras Candida albicans y

Candida tropicalis, caracterizado porque comprende dos sustratos: 5

- un primer sustrato, cromógeno o fluorígeno, constituido por una parte marcador y por una parte susceptible de ser hidrolizada por una enzima del grupo de las hexosaminidasas, y

-un segundo sustrato, cromógeno o fluorígeno, constituido por una parte marcador y por una parte susceptible 10 de ser hidrolizada por una enzima del grupo de las glucosidasas.

siendo dicha parte marcador del segundo sustrato diferente de la parte marcador del primer sustrato.

2. Medio según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un activador de hexosaminidasa 15

3. Medio según la reivindicación 2, caracterizado porque el activador está constituido por una hexosamina y/o una hexosaminidina.

4. Medio según las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque comprende un activador específico de la enzima 20 hexosaminidasa de C. albicans.

5. Medio según la reivindicación 4, caracterizado porque el activador específico de la enzima hexosaminidasa es la N-acetil-glucosamina.

6. Medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el primer sustrato de la hexomanidasa está constituido por un derivado de indoxilo y/o porque el segundo sustrato de glucosidasa está constituido por un derivado de indoxilo.

7. Medio según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio es líquido o gelificado. 30

8. Procedimiento de análisis microbiológico para detectar e identificar selectivamente algunas especies de levaduras Candida, caracterizado porque se pone la muestra directamente en contacto con un medio según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, porque se espera a que aparezcan unas coloraciones en el medio, y porque se identifican, mediante estas diferencias de coloración, las C. albicans con respecto, por un lado, a las C.

guillermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C. tropicalis y, por otro lado, a las otras Candida, así como las C. guillermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C. tropicalis, con respecto a las otras Candida.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se espera entre 36 y 60 horas y de forma ventajosa sustancialmente 48 horas, cuando el medio no contiene ningún activador según la reivindicación 5. 40

10. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se espera entre 18 y 30 horas y de forma ventajosa sustancialmente 24 horas, cuando el medio contiene un activador según la reivindicación 5.