Marcadores de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos.

Un marcador quimioluminiscente de éster de acridinio detectable que tiene la estructura genérica A-B-C,

y que comprende un éster de acridinio con un modificador hidrófilo,

dónde A es un analito diana,

dónde B es el modificador hidrófilo que consta de un espaciador poliiónico seleccionado del grupo que contiene de disulfonato de espermina poliiónico y dicarboxilato de espermina poliiónico, y

dónde C es el marcador quimioluminiscente de éster de acridinio.

Marcadores de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos Campo de la Invención

La presente invención es útil en aplicaciones bioanalíticas y por lo general se dirige a los marcadores detectables quimioluminiscentes de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos; a las composiciones, los complejos y/o los conjugados que incluyen tales marcadores; y a los procesos para llevar a cabo ensayos bioanalíticos para analitos diana que utilizan tales marcadores.

Antecedentes de la Invención

Los ásteres de acridinio son marcadores quimioluminiscente enormemente útiles que han sido utilizados ampliamente en el campo de inmunoensayos así como ensayos de ácido nucleico. Cada uno de los siguientes documentos de patentes se dirige a diferentes aspectos de aplicaciones bioanalíticas de compuestos de éster de acridinio. EP0263657; US4745181;EP0353971; EP0361817; US4918192; US5110932; US5227489; US5241070; EP0617288; W09421823; US5395752; EP0661270; US5449556; WO9527702; US5538901; US5595875; EP0754178; US5656426; US5656500; US5663074; US5702887; W09854574; US5879894; W09911813; W00009487; EP0982298; WO 0031543; WO 98 545 74; US 6 242 188; EP0988551; W00031543; EP1009852; US6080591; EP1049933; US6165800; WO0109372 & EP1104405.

Ciertos marcadores detectables quimioluminiscentes de éster de acridinio particulares que carecen de modificadores hidrófilos son bien conocidos en la técnica - por ejemplo, 2,6-dimetil-4-[N-succinimidiloxicarbonil]fenil-10-metil-9- acridina carboxilato y 2,6-dimetil-4-[N-succinimidiloxicarbonil]fenil-10-sulfopropil-9-acridina carboxilato {siendo cada marcador de ahora en adelante denominado como, respectivamente, "DMAE-NHS" y "NSP-DMAE-NHS"} - y están siendo comercializados para sistemas instrumentales de inmunoensayo disponibles de Bayer Corporation, Business Group Diagnostics, 511 Benedict Avenue, Tarrytown, New York 10591-5097. Para la conveniencia del lector, la estructura de cada uno de estos compuestos se describe a continuación.

Descripción Detallada de la Invención

Como se ha indicado previamente, la presente invención se dirige a los marcadores detectables quimioluminiscentes de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos de acuerdo con la reivindicación 1 y el proceso de acuerdo con la reivindicación 6. En varias modalidades preferidas de los marcadores de la invención, hemos incorporado dos (2) tipos de elementos estructurales en NSP-DMAE y hemos encontrado que estas modificaciones permiten la preparación de trazadores de haptenos únicos que muestran el rendimiento mejorado en inmunoensayos. Mediante el empleo de tres (3) diferentes analitos relevantes clínicamente -a saber- (la vitamina folato, el fármaco para el

DMAE-NHS

NSP-DMAE-NHS

O

O

asma teofilina, y el antibiótico de aminoglucósidos, tobramicina) hemos demostrado la generalidad de nuestros hallazgos.

Antes de examinar en profundidad los presentes marcadores de la Invención, se presenta a continuación una breve descripción de los formatos de ensayo. Los inmunoensayos competitivos comúnmente: (a) emplean un formato dónde se utiliza un conjugado de un marcador fluorescente o quimioluminiscente con un analito de interés, como un trazador en el ensayo; y (b) utilizan un soporte sólido. Una arquitectura típica para dicho ensayo competitivo consiste de tres componentes -a saber- un trazador, una muestra que contiene el analito de interés, y un método para la separación del analito unido y sin unir. (Se debe observar que en los inmunoensayos homogéneos, sin embargo, no se realiza ninguna separación). Por ejemplo, la inmovilización de la proteína de enlace del ácido fólico sobre un soporte sólido tal como partículas paramagnéticas (de ahora en adelante denominado como "PMP") provee un medio para lograr dicha separación (magnética) del analito libre y unido (analito que en este caso sería el ácido fólico). Cuando el trazador se incluye en el ensayo, compite con el analito de la muestra para el enlace con la proteína inmovilizada. El aumento de los niveles del analito en el ensayo da lugar a que menos trazador se una con la proteína inmovilizada.

Como se describe a continuación en detalle (y como se ejemplifica más adelante) los espaciadores que son particularmente útiles para la preparación de trazadores de hapteno se han desarrollado - disulfonato de espermina poliiónica y dicarboxilato de espermina poliiónica -.

También se revela que el polietilenglicol (de ahora en adelante denominado como "PEG") es un polímero bien conocido. Es biocompatible, soluble tanto en solventes acuosos como orgánicos, no tóxico, y no inmunogénico. En la técnica anterior, se ha utilizado ampliamente como un modificador de una variedad de moléculas que van desde fármacos de peso molecular pequeño a proteínas grandes así como también agregados grandes tales como liposomas. Los conjugados de PEG de fármacos muestran una solubilidad mejorada y tienen una vida mayor en el flujo sanguíneo. La modificación de PEG de las proteínas y los péptidos mejora la solubilidad, confiere resistencia a la proteólisis, y reduce la inmunogenicidad. La modificación de PEG de los oligonucleótidos aumenta la solubilidad y confiere estabilidad a la nucleasa. La modificación de PEG de lípídos permite la preparación de liposomas injertados con PEG que están estabilizados estéricamente y muestran tiempos de circulación en sangre mejorados. Una excelente revisión de la técnica anterior en los usos de PEG se describe por S. Zalipsky in Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 150-165 (que se Incorpora en este documento por referencia en su totalidad). El uso de PEG para modificar las propiedades de colorantes fluorescentes también se describe en la técnica anterior. Se ha demostrado que los colorantes fluorescentes porfiriña y ftalocianina modificados con PEG muestran una disminución del comportamiento de agregación en solución acuosa así como un enlace no-específico disminuido con los componentes del suero humano tales como HSA (Albúmina de Suero Humano). Estos conjugados también muestran tiempos de decaimiento de fluorescencia ampliados (PCT/US91/03424 y PCT/US91/03426). Las aplicaciones de tales conjugados en Inmunoensayos de fluorescencia e imágenes in vivo y terapia de tumores in vivo fueron propuestas por los mismos autores.

No obstante de los usos anteriores de PEG, la modificación de ásteres de acridinio con polietilenglicol no se ha descrito previamente. Del mismo modo, también se han reportado los espaciadores poliiónicos ideados utilizando la poliamina espermina como un andamio de introducción de grupos funcionales iónicos. Encontramos que estas últimas moléculas también son enormemente útiles para modificar los ásteres de acridinio. La síntesis y las aplicaciones de estos ásteres de acridinio modificados siguen.

Como se menciona anteriormente, la vitamina ácido fólico es un analito importante clínicamente que se mide comúnmente utilizando técnicas de inmunoensayo. Como un compuesto estrechamente relacionado, el ácido pteroico es una variante estructural, específica del ácido fólico que carece de la fracción de glutamato normalmente encontrada en el ácido folleo. Preparamos dos (2) diferentes conjugados NSP-DMAE de ácido pteroico, uno que contiene un espaciador alifático hidrófobo (hexametileno) mientras que el otro contiene un espaciador del glicol hidrófilo hexaetileno (véase las Figuras 1 & 2). La síntesis del primer trazador se llevó a cabo por medio de la reacción de NSPDMAE- NHS con 1,6-hexanodiamina (de ahora en adelante, denominada como "HD"). A continuación, el derivado del éster de acridinio resultante (de ahora en adelante denominado como "NSP-DMAE- HD") se condensó con el ácido N10-trifluoroacetil pteroico seguido por la eliminación del grupo protector trifluoroacetil a partir del conjugado. Para preparar un trazador análogo con un espaciador de PEG, un diaminohexaetilenglicol corto se sintetizó a partir del hexaetilenglicol disponible comercialmente. Los dos grupos hidroxilo en el hexaetilenglicol se convierten a ásteres de metano sulfonato, que se desplazan posteriormente con azida. La reducción del diazidohexaetilenglicol proporcionó el diaminohexaetilenglicol que luego se condensó con NSPDMAE- NHS. El derivado de éster de acridinio resultante (de ahora en adelante denominado como "NSP-DMAE-HEG") se acopló con el ácido pteroico como se plantea anteriormente.

El rendimiento del ensayo de estos dos (2) diferentes conjugados NSP-DMAE-pteroato luego se evaluó en un inmunoensayo de folato (Ejemplo 5, las Tablas 1-3 & Figura 3). En este formato de ensayo, la proteína de enlace folato se inmoviliza sobre PMP y los dos (2) trazadores compiten con el analito... [Seguir leyendo]

1. Un marcador quimioluminiscente de éster de acridinio detectable que tiene la estructura genérica A-B-C, y que comprende un éster de acridinio con un modificador hidrófilo,

dónde A es un analito diana,

dónde B es el modificador hidrófilo que consta de un espaciador poliiónico seleccionado del grupo que contiene de disulfonato de espermina poliiónico y dicarboxilato de espermina poliiónico,

y

dónde C es el marcador quimioluminiscente de éster de acridinio.

2. Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y capaz de realizar ensayos de folato.

3. Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y capaz de realizar ensayos de teofilina.

4. Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y capaz de realizar ensayos de tobramicina.

5. Un complejo, que comprende:

(a) un marcador como se define en la reivindicación 1;

(b) un socio de enlace del analito diana; y

(c) en donde el analito diana dentro del marcador se une al socio de enlace.

6. Un proceso para llevar a cabo un ensayo que comprende,

(a) exposición de una muestra sospechosa de contener un analito diana a un marcador como se define en la reivindicación 1 y a un socio de enlace correspondiente para el analito diana;

(b) determinación el nivel en el cual el marcador evita y/o se desplaza competitivamente por el analito diana de la muestra, para formar una interacción de enlace con el socio de enlace correspondiente;

(c) correlación de la determinación realizada en la anterior etapa (b) con la presencia o cantidad de analito diana de la muestra.