Manipulación de la senescencia vegetal mediante promotores modificados.

Un método para manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº:

1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

Manipulación de la senescencia vegetal mediante promotores modificados La presente invención se refiere a métodos para manipular la senescencia en plantas. La invención también se refiere a vectores de utilidad en dichos métodos, plantas transformadas con características de senescencia modificadas y células vegetales, semillas y otras partes de dichas plantas.

La senescencia de la hoja incluye cambios metabólicos y estructurales de las células antes de la muerte celular. También incluye el reciclado de nutrientes hacia las regiones de crecimiento activo.

La regulación de la senescencia de plantas y órganos de plantas por citoquininas tiene importantes consecuencias agrícolas. Los niveles elevados de citoquininas en hojas tienden a retardar la senescencia. Se han usado numerosos promotores para regular la expresión del gen ipt, cuyo producto (isopenteniltransferasa) cataliza una etapa clave en la síntesis de citoquininas. Sin embargo, en general, se ha informado que las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen ipt tienen retraso de crecimiento de raíces y brotes, sin formación de raíces, reducida dominancia apical y reducida superficie de la hoja.

Los documentos WO 02/20772 A1, Lin et al. (2003) Plant Science 165 (6) :1437-1444, Kranz et al. (1998) Plant Journal 16 (2) :263-276, y WO 1996/29858 A1 se refieren a la modificación de la senescencia vegetal por expresión génica, sin embargo se distinguen de la presente invención, entre otros, por el promotor empleado. Li et al. (1996) FEBS Letters 379:117-121 y Sidorenko et al. (2000) Plant Journal 22 (6) :471-482 describen promotores del gen myb diferentes del de la presente invención.

Un objetivo de la presente invención consiste en superar o al menos aliviar una o más de las dificultades o deficiencias asociadas en la técnica previa.

La invención puede definirse por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente invención provee un método para manipular la senescencia en una planta de acuerdo con la reivindicación 1, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.

La manipulación de la senescencia se refiere a la planta y/o órganos vegetales específicos. Se puede manipular la senescencia de diferentes órganos vegetales, tales como hojas, raíces, brotes, tallos, tubérculos, flores, estolones y frutas. La manipulación de la senescencia de plantas y de órganos de plantas puede tener importantes consecuencias agrícolas, tales como aumento de la vida de depósito por ejemplo de frutas, flores, hojas y tubérculos en productos hortícolas y flores cortadas, reducción del perecimiento de cultivos hortícolas, aumento de la fijación de carbono en hojas con senescencia retardada que conducen a aumento de los rendimientos, aumento de la producción de biomasa en plantas forrajeras, aumento de la producción de semillas, etc.

“Manipulación de la senescencia” se refiere en general a retrasar la senescencia en la planta transformada respecto de una planta control no transformada. Sin embargo, para algunas aplicaciones puede ser deseable promover o de otro modo modificar la senescencia en la planta. La senescencia se puede promover o de otro modo modificar por ejemplo, mediante la utilización de un gen antisentido.

Una cantidad efectiva de dicha construcción génica se puede introducir en dicha planta por cualquier técnica adecuada, por ejemplo por transducción, transfección o transformación. Por “una cantidad efectiva” se entiende una cantidad suficiente para dar un rasgo fenotípico identificable en dicha planta o una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de ella. Dichas cantidades pueden ser determinadas con facilidad por las personas con la pericia correspondiente, si se tiene en cuenta el tipo de planta, la vía de administración y otros factores relevantes. Dicha persona podrá fácilmente determinar una cantidad y un método de administración adecuados. Ver, por ejemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laborator y , Cold Spring Harbor, cuya descripción total se incorpora en la presente por referencia.

Por “promotor de gen modificado myb” se entiende un promotor asociado normalmente con un gen myb, en donde el promotor está modificado para eliminar o inactivar uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen en dicho promotor.

Si bien el solicitante no desea estar restringido por la teoría, se postula que la eliminación o la inactivación de uno o más motivos específicos de raíz de dicho promotor de gen myb puede aliviar o superar el problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en los meristemas vegetales, lo cual puede afectar el desarrollo de la raíz en algunas especies de plantas. También se postula que la eliminación o la inactivación de uno o más motivos específicos de polen de dicho promotor de gen myb pueden aliviar o superar el

problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en polen, lo cual puede afectar el desarrollo del polen en algunas especies de plantas.

Preferentemente el promotor modificado de gen myb es un promotor modificado de gen myb32. Preferentemente el 5 promotor modificado de gen myb proviene de Arabidopsis, más preferentemente Arabidopsis thaliana.

Un promotor adecuado que se puede modificar de acuerdo con la presente invención se describe en Li et al., Cloning of three MYB-like genes from Arabidopsis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:313 (1999) .

Por “motivo específico de raíz” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 5 nucleótidos, que dirige la expresión de un gen asociado en las raíces de una planta.

De preferencia, el motivo específico de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT.

De preferencia, entre uno y diez, con mayor preferencia entre tres y ocho, con aún mayor preferencia entre cinco y siete motivos específicos de raíz se eliminan o inactivan, de preferencia se eliminan, en dicho promotor de gen myb.

Los motivos específicos de raíz se pueden eliminar mediante la remoción de motivos individuales o por remoción de un fragmento del promotor que contiene uno o más motivos. Por ejemplo, se puede eliminar la totalidad o parte de la 20 región entre los nucleótidos 1 y 530, de preferencia entre los nucleótidos 110 y 530 del promotor de gen myb de Arabidopsis thaliana.

La eliminación se puede efectuar por corte del ácido nucleico, por ejemplo mediante endonucleasas de restricción, y ligadura de los extremos cortados a fin de generar un promotor con un fragmento extraído.

Por ejemplo, un promotor modificado del gen myb de Arabidopsis thaliana se puede preparar al extraer un fragmento entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525. Esto genera un promotor modificado de gen myb con 6 de los 7 motivos específicos de raíz eliminados. Alternativamente, se pueden eliminar todos los 7 motivos específicos de raíz, por ejemplo al eliminar la región corriente arriba respecto del sitio SspI en las posiciones 520-525, o por eliminación de la región entre los nucleótidos 1 y 120 junto con la región entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525.

Un motivo específico de raíz se puede inactivar por agregado, eliminación, sustitución o derivación de uno o más nucleótidos dentro del motivo, por lo que ya no tiene la secuencia de consenso preferido.

Preferentemente el promotor modificado del gen myb incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 2, 3 y 4 de la presente (Secuencias ID No: 2, 3 y 4, respectivamente) y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

Por “motivo específico de polen” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 4 o 5 nucleótidos, la cual dirige la expresión de un gen asociado en el polen de una planta.

De preferencia, el motivo específico de polen incluye una secuencia de consenso seleccionada del grupo que consiste en TTCT y AGAA.

De preferencia, entre uno y treinta, con mayor preferencia entre tres y quince, con aún mayor preferencia entre cuatro y diez motivos... [Seguir leyendo]

1. Un método para manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que entre uno y diez, preferentemente entre tres y ocho, preferentemente entre cinco y siete motivos específicos de raíz se suprimen o inactivan en dicho promotor del gen myb.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que entre uno y treinta, preferentemente entre tres y quince, preferentemente entre cuatro y diez motivos específicos de polen se suprimen o inactivan en dicho promotor del gen myb.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenil transferasa (ipt) o sho, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacones 1 a 4, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID No: 5, 7 y 9, secuencias que codifican los polipéptidos que tienen una secuencia de las Secuencias ID No: 6, 8 y 10, y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, teniendo dicho promotor del gen myb entre uno y diez motivos específicos de raíz suprimidos o inactivados, teniendo dichos motivos específicos de raíz una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o teniendo entre uno y treinta motivos específicos de polen suprimidos o inactivados, teniendo dichos motivos específicos de polen una secuencia de consenso TTCT o AGAA; estando dicho promotor modificado del gen myb ligado operativamente a un gen ipt o sho.

7. Un vector capaz de manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho vector un promotor modificado del gen myb, que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenil transferasa (ipt) o sho o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

9. Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica, con características de senescencia modificadas, incluyendo dichas célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye

una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

10. Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica, de acuerdo con la reivindicación 9 producida por un método que incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en el que dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

11. Una planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica derivada de una célula vegetal o planta de acuerdo con la reivindicación 10 y que comprenden dicha construcción genética.

12. Un método para incrementar la biomasa en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

13. Un vector capaz de incrementar la biomasa en una planta, incluyendo dicho vector un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tiene al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº : 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en en el que dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

(a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

(b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

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