Lísis selectiva de células.

Un procedimiento para la lisis selectiva de células animales en una muestra que contiene,

o se sospecha que contiene, un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

- a) proporcionar una muestra con células animales que contiene, o se sospecha que contiene un microorganismo,

- b) añadir un detergente no iónico y un tampón a dicha muestra para obtener una solución con un pH de aproximadamente 9,5 o superior, en la que la relación entre el volumen de detergerte añadido y el tampón añadido y el volumen de muestra está entre 2/1 y 1/10,

- c) incubar dicha solución durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo para lisar las células animales

Lisis selectiva de células.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la lisis de células eucariotas, en particular células animales, 5 tales come células sanguíneas. La presente invención se refiere adicionalmente a la detección de bajas concentraciones de microorganismos tales como bacterias en muestras con altas concentraciones de otras células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

El diagnóstico molecular tiene como objetivo la detección rápida de cantidades mínimas de patógenos (típicamente bacterias) es muestras tal como sangre. Sin embargo, la sangre es una matriz compleja y comprende glóbulos blancos (leucocitos) para el sistema inmune adaptativo, glóbulos rojos (eritrocitos) para el transporte de oxígeno, y plaquetas (trombocitos) para la cicatrización de heridas. Esto complica la detección directa de patógenos en muestras tal como 15 sangre completa, que contienen una gran cantidad de material celular.

Los procedimientos de detección clásicos comprenden el crecimiento de bacterias en medios selectivos y/o medios con indicadores. Típicamente, dichos ensayos requieren una etapa de cultivo de al menos 1 ó 2 días antes de que pueda tener lugar la identificación. 20

Para los procedimientos basados en PCR, la cantidad de bacterias en una muestra de sangre fresca es en teoría lo suficientemente alta para detectarse sin un cultivo adicional de las bacterias presentes en dicha muestra. Sin embargo, pare permitir una detección temprana de cantidades mínimas de bacterias, se requieren grandes volúmenes de sangre. La gran cantidad 25 de ADN especialmente en los glóbulos blancos, aumenta dramáticamente los antecedentes en los procedimientos de detección basada en ADN. Además, la presencia de hemo procedente de la hemoglobina disminuye fuertemente la actividad de la ADN polimerasa. Un microlitro de sangre humane contiene aproximadamente de 4.000 a 11.000 glóbulos blancos y aproximadamente de 150.000 a 400.000 plaquetas. La concentración de ADN en sangre está 30 entre 30 y 60 μl/ml. Es extremadamente difícil detectar en un volumen de 10ml de sangre completa la presencia de aproximadamente 10 a 100.000 de una especie bacteriana.

Las elevadas cantidades de ADN de los glóbulos blancos pueden dar lugar a productos de PCR no relevantes, o pueden eliminar los cebadores diseñados pare la detección de ADN 35 bacteriano. Esto requiere una minuciosa purificación de ADN y la separación de ADN mamífero antes de que el ADN bacteriano pueda detectarse a través de PCR u otros procedimientos.

Además de interferir con la propia reacción de PCR, la cantidad de ADN mamífero aumenta la viscosidad de una muestra. Además, las proteínas y las membranas de las células mamíferas 40 sometidas a lisis forman complejos que impiden la filtración de una muestra. Esto es particularmente un problema para los dispositivos miniaturizados. La dilución adición del ya gran volumen de muestra da coma resultado largas etapas de manipulación inaceptables.

Por los motives anteriores, se requieren en consecuencia procedimientos pare extraer ADN 45 humano de una muestra de sangre.

Se conocen procedimientos para ensayar específicamente el ADN bacteriano en presencia de ADN mamífero. Looxterâ¢, de la empresa SIRSLab, usa un procedimiento para enriquecer el ADN metilado de una muestra. Puesto que el ADN bacteriano este fuertemente metilado, este 50

enfoque da como resultado un enriquecimiento del ADN bacteriano. MolysisTM, de la empresa Molzym, usa agentes caotrópicos y detergentes para lisar selectivamente células mamíferas. Esta etapa de lisis se sigue de una digestión con una ADNasa que no se ve afectada por este agente caotrópico/detergente. Los enfoques alternativos, tales como los comercializados por Roche (Septifastâ¢) se basan en pares de cebadores de PCR que están diseñados 5 específicamente para impedir Ia unión inespecífica a ADN humano y la amplificación de ADN humano.

El documento US 6.803.208 describe un procedimiento en el que una suspensión altamente diluida de plaquetas sanguíneas dopada con bacterias se lisa a 37 º C durante 15 minutos, 10 después de lo cual es posible filtrar una pequeña cantidad de muestra lisada sobre un filtro de 0, 4 μm para realizar una inspección visual de las bacterias que están retenidas en el filtro. Sin embargo, este procedimiento no permite procesar grandes volúmenes de muestra a temperatura ambiente.

Sullivan N M y col. ("Practical aerobic membrane filtration blood culture technique: development of procedure", Journal of Clinical Microbiology, vol. 1, Nº 1, enero de 1975) desvelan diversos tampones pare la lisis selectiva de células sanguíneas para detectar microorganismos en la sangre. El documento WO 00/72970 A1 (Cepheid, 7 de diciembre de 2000) desvela un dispositivo de cartucho para la detección de ADN. 20

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento pare la lisis selectiva de células 25 animales, en una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo. Este procedimiento comprende las etapas de proporcionar una muestra con células eucariotas, en particular, células animales, que contiene, o se sospecha que contiene un microorganismo, añadir un detergente no iónico y un tampón a la muestra pare obtener una solución con un pH de aproximadamente 9, 5 o más, e incubar la solución durante un periodo de tiempo lo 30 suficientemente largo para lisar las células animales, por ejemplo, entre 30 segundos y 10 minutos, más preferiblemente entre 2 y 6 minutos. La lisis puede realizarse en realizaciones particulares entre 15 y 30 º C, más preferiblemente aproximadamente la temperatura ambiente.

En realizaciones particulares, la muestra as una muestra de sangre de mamífero, tal como 35 sangre complete.

En otras realizaciones particulares, el microorganismo es una bacteria u hongo.

De acuerdo con realizaciones particulares, la relación entre el volumen de detergente añadido y 40 de tampón añadido y el volumen de muestra está entre 2/1 y 1/10.

En realizaciones particulares, el detergente no iónico se selecciona entre el grupo que comprende Nonidet, Brij, Tween, Igepal, triton reducido, octilglucósido, colato y Triton. Ejemplos más preferidos son Tritón X-100, Nonidet P40, desoxicolato sódico y/o lgepal CA 630. 45

En realizaciones particulares, el tampón alcalino, como se usa en el presente documento, tiene un valor pKa por encima de 9. Ejemplos del mismo son borato, carbonato, CAPS (N-ciclohexil-3-amino-propanosulfónico) , CAPSO (ácido 3- (ciclohexilamino) -2-hidroxi-1-propanosulfenico) , CHES (ácido 2- (N-ciclohexilamino) etano sulfónico) , pirofosfato y etanolamina. Un ejemplo 50 particular es carbonato sódico. El tampón debe tener suficiente capacidad de tampón que cuando se mezcla con la muestra en relaciones de acuerdo con la presente invención, el pH de la solución final es de aproximadamente 9, 5 o superior.

En realizaciones particulares, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de filtrar la solución incubada en un filtro con un tamaño de poro que retiene microorganismos en el filtro, 5 tal como un filtro con un tamaño de poro de menos de 0, 7 μm, más preferiblemente menos de 0, 5 μm. El procedimiento de la presente invención facilita la filtración de elevados volúmenes de muestra sin etapas del proceso enzimático o termo-relacionado.

En realizaciones particulares, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de añadir, 10 después de la lisis selectiva de acuerdo con la invención, un ácido o un tampón ácido para obtener un pH entre aproximadamente 7 y 9, una "etapa de neutralización".

En realizaciones particulares, los procedimientos que se han descrito anteriormente están seguidos de detección de los microorganismos. Ejemplos de los mismos son citometría, 15 microscopia, PCR o cultivo.

En realizaciones particulares, los procedimientos que se han descrito anteriormente, están seguidos de la lisis de microorganismos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo (1) para la detección de microorganismos en una muestra, que comprende: una cámara de lisis (2) para aceptar un fluido de muestra con un volumen por debajo de 40 ml, preferiblemente por debajo de 20 ml, y más preferiblemente entre 1 y 20 ml, un depósito (3) que comprende un tampón alcalino con un pH de aproximadamente 9, 5 o más, y que comprende un detergente no iónico, o un depósito 25 quo comprende un tampón alcalino (31) con un pH de aproximadamente 9, 5 o más, un depósito que comprende un... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la lisis selectiva de células animales en una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

- a) proporcionar una muestra con células animales que contiene, o se sospecha que contiene un microorganismo,

- b) añadir un detergente no iónico y un tampón a dicha muestra para obtener una solución con un pH de aproximadamente 9, 5 o superior, en la que la relación entre el volumen de detergerte 10 añadido y el tampón añadido y el volumen de muestra está entre 2/1 y 1/10,

- c) incubar dicha solución durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo para lisar las células animales.

2. Un procedimiento para la lisis selectiva de células animales en una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

- a) proporcionar una muestra con células animales que contiene, o se sospecha que contiene, 20 un microorganismo,

- b) añadir un detergente no iónico y un tampón a dicha muestra para obtener una solución con un pH de aproximadamente 9, 5 o superior, en la que el detergente no iónico está presente en una concentración en el intervalo de entre el 0, 1 y el 5 % (% p/v p % v/v) , 25

- c) incubar dicha solución durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo pare lisar las células animales.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha muestra es una 30 muestra de sangre de mamífero.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha muestra de sangre es sangre completa.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho microorganismo es una bacteria.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho microorganismo es un hongo. 40

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha etapa de incubación c) se realiza entre 30 segundos y 10 minutos.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la 45 relación entre el volumen de detergente añadido y de tampón añadido y el volumen de muestra está entre 2/1 y 1/10.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 7, en el que el detergente no iónico está presente en una concentración del 0, 1 y el 5% (% p/v o % v/v) . 50

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el detergente no iónico se selecciona entre el grupo que comprende Nonidet P40, desoxicolato, lgepal CA 630) y/o Triton-X 100.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende 5 adicionalmente la etapa de centrifugar dicha solución incubada y aislar dichos microorganismos.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente la etapa de filtrar dicha solución incubada en un filtro con un tamaño de poro 10 que retiene los microorganismos en dicho filtro.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende adicionalmente la etapa de lisar dichos microorganismos.

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende adicionalmente un ensayo molecular basado en ácidos nucleicos.

15. Un dispositivo (1) para la detección de microorganismos en la muestra, que comprende:

- una cámara de lisis (2) para aceptar un fluido de muestra con células animales que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo un microorganismo con un volumen por debajo de 40

- un deposito (3) que comprende un tampón alcalino con un pH de 9, 5 o superior, y que 25 comprende un detergente no iónico, o un deposito que comprende un tampón alcalino (31) con un pH de aproximadamente 9, 5 o más, y un deposito que comprende un detergente no iónico (32) , conectado a la cámara de lisis,

- un filtro (4) conectado a la cámara de lisis para filtrar la muestra después de la lisis de células 30 animales, teniendo dicho filtro un tamaño de poro que retiene bacterias en el filtro, y

- una cámara de detección (5) para ensayar la presencia de ADN.

16. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el tampón alcalino tiene un pKa 35 por encima de 9, 0 y/o el detergente no iónico es Triton X-100.