Procedimiento para la purificación de soluciones enzimáticas concentradas.

Procedimiento para la purificación de soluciones enzimáticas concentradas que contienen compuestos de Maillard de color,

que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una solución enzimática concentrada,

(b) separación de sólidos, en particular de proteínas extrañas y/o enzimas inactivas y

(c) separación de los compuestos de Maillard de color mediante adsorción a un intercambiador aniónico fuertemente básico, en el que el intercambiador aniónico fuertemente básico presenta grupos amonio cuaternarios como grupos funcionales, tiene una capacidad de intercambio de 0,7 a 1,2 meq/ml, presenta un tamaño de poro efectivo de 0,2 a 0,7 mm y se basa en un polímero de plástico poroso como material de soporte, en el que el intercambiador aniónico fuertemente básico en un intervalo de pH de 5 - 9 presenta capacidad de intercambio máxima,

caracterizado porque en la solución enzimática concentrada mediante la etapa (b) no se obtiene más del 1 % en volumen de sólido y las proteínas enzimáticas permanecen en solución a lo largo de todo el procedimiento.

Procedimiento para la purificación de soluciones enzimáticas concentradas

La presente invención se refiere a procedimientos para la purificación de soluciones enzimáticas técnicas concentradas, a los productos de procedimiento y agentes correspondientes, que se basan en tales soluciones, en particular agentes de lavado y de limpieza.

Las enzimas, en particular aquellas para campos de uso técnicos se producen hoy en día en la mayoría de los casos mediante fermentación de microorganismos, y a continuación se purifican a partir de los medios en cuestión. Las soluciones enzimáticas concentradas obtenidas a través de, en la mayoría de los casos, varias etapas de procedimiento secuenciales, se denominan a menudo también como "enzima líquida". La enzima líquida puede considerarse como materia prima purificada que, o bien se usa en forma líquida o, más raramente, se convierte en una forma seca y entonces se suministra a aplicaciones correspondientes.

Campos de uso técnicos importantes para enzimas, en particular en forma líquida, son agentes de lavado y de limpieza, que se ofrecen cada vez más también en forma líquida o forma de gel. Otros campos de uso se encuentran por ejemplo en el de la cosmética, usándose las enzimas tal como en agentes lavado y de limpieza como agentes activos, o el de la producción y el procesamiento de materiales textiles o el de la producción de alimentos, haciéndose reaccionar en primer lugar las materias primas mediante el uso de las enzimas para dar el verdadero producto.

Procedimientos de purificación o de enriquecimiento para la obtención de soluciones enzimáticas concentradas se describen en detalle en el estado de la técnica. Objetivos importantes son en este sentido la separación de la biomasa, es decir de los constituyentes en particular macromoleculares de los organismos huésped, la separación de sustancias acompañantes de bajo peso molecular e impurezas, en particular constituyentes del medio y metabolitos, y la separación de otras proteínas, en particular enzimas. Al mismo tiempo el producto de interés se obtendrá en las mayores cantidad y pureza posibles y una actividad lo más alta posible. Por otro lado los sobrenadantes de cultivo contienen en la mayoría de los casos factores, con frecuencia péptidos o proteínas, cuya identidad a menudo no se conoce aún, pero que en cambio proporcionan una estabilización de la enzima de interés. Por este motivo es especialmente ventajoso obtener una solución enzimática no completamente pura sino una que contenga un cierto porcentaje de tales sustancias acompañantes estabilizadoras.

Para el fin de la purificación se emplean en la mayoría de los casos técnicas que se basan en filtración, sedimentación o precipitación.

De este modo se han desarrollado por ejemplo para la separación de la biomasa por regla general procedimientos que han de aplicarse sucesivamente y se han establecido en el estado de la técnica. A estos pertenecen por ejemplo la separación, microfiltración y ultrafiltración. Sólo después puede hablarse en el sentido de la invención verdaderamente de un concentrado enzimático.

De este modo por ejemplo de la solicitud WO 1/37628 A2 se desprende un procedimiento para la obtención de sustancias de valor producidas biotecnológicamente a partir de soluciones de cultivo y/o de termentador, que comprende la separación de los sólidos insolubles en agua de la solución acuosa, que contiene las sustancias de valor, posterior filtración de la solución obtenida y concentración de la solución que contiene sustancias de valor por medio de ultrafiltración. Se caracteriza porque los sólidos separados se someten a una etapa de lavado, usándose como líquido de lavado el filtrado de la etapa de concentración.

Además queda por resolver sin embargo el problema de que los concentrados enzimáticos separados de la biomasa contienen en particular las siguientes sustancias acompañantes:

1. sólidos en particular precipitaciones de proteínas desnaturalizadas de forma irreversible, también de la proteína de interés,

2. compuestos de color, en la mayoría de los casos de color marrón, que se han generado durante la esterilización previa a la fermentación de los constituyentes del medio, especialmente de las fuentes de nitrógeno (compuestos de Maillard), y

3. factores, que aumentan la estabilidad de la proteína de interés.

Los métodos de purificación convencionales son adecuados sólo en medida insuficiente para eliminar a partir de un concentrado enzimático separado de la biomasa proteínas desnaturalizadas y compuestos de color; o eliminan junto con éstos también una gran parte de los factores estabilizadores. La consecuencia de esto es en cualquier caso una calidad de producto no satisfactoria: o bien el concentrado enzimático presenta un color oscuro, estrías y/o partículas en suspensión hasta sustancias precipitadas, o bien, en el caso de un color claro y una solución clara dispone de una estabilidad enzimática insuficiente; esto último puede compensarse en la mayoría de los casos sólo en cierta medida mediante la adición de compuestos estabilizadores (caros). Estas desventajas repercuten en particular en los productos en los que se incorpora el concentrado en cuestión.

Por ejemplo los agentes de lavado o de limpieza líquidos deberán contener a lo largo del tiempo del almacenamiento

un porcentaje lo más alto posible de enzima activa, es decir estable. A este respecto se comportan sin embargo el contenido en agua y la estabilidad de manera proporcionalmente inversa entre sí. Al mismo tiempo estos agentes tendrán un color agradable para el usuario y un aspecto claro.

En el estado de la técnica se describen procedimientos para la decoloración de soluciones enzimáticas concentradas. A estos pertenecen métodos de precipitación, por ejemplo con disolventes orgánicos o polímeros, en particular también la precipitación por sales de la proteína de interés con sulfato de sodio (se describe en H.Ruttloff (1994): "Industrielle Enzyme" Behrs Verlag, Hamburgo, capítulo 6.3.3.6, páginas 376 a 379). De este modo, por ejemplo por la patente estadounidense US 545767 se desprenden determinados compuestos que deben añadirse a la solución de proteína que va a precipitarse para obtener precipitados ventajosos. En este sentido se precipita la proteína, permaneciendo en el sobrenadante las sustancias acompañantes. No obstante mediante la precipitación y resuspensión se desnaturaliza una parte de la proteína de forma irreversible y se perjudica en conjunto la estabilidad; no menos importante también se separan compuestos que deben estabilizarse. Como rendimientos que deben alcanzarse se indican en la Tabla en la página 378 del libro de texto mencionado aproximadamente el 5 %.

Una alternativa adicional consiste en la purificación por adsorción de las enzimas, por ejemplo a través de una resina de intercambio iónico (H.Ruttloff (1994): "Industrielle Enzyme" Behrs Verlag, Hamburgo, capítulos 6.3.3.7 y 6.3.3.8, páginas 379 a 396). En este sentido las proteínas de interés se unen a un material de cromatografía y se eluyen a continuación con otro medio. No obstante, de este modo, debido a los efectos de la desnaturalización y del plegamiento, se consiguen así mismo en la mayoría de los casos sólo malos rendimientos. De este modo para distintos procedimientos de cromatografía (aparte de la cromatografía de afinidad) en la tabla de la página 378 se indican valores de rendimiento de como máximo aproximadamente el 6 %. Los materiales específicos, en particular los materiales de cromatografía de afinidad son en general conductores, pero también muy sensibles y costosos de producir. Por lo tanto, estos últimos no encuentran sin embargo prácticamente ninguna aplicación principalmente en la analítica y la tecnología médica, en la producción de enzimas a gran escala.

De este modo, por ejemplo la solicitud de patente WO 89/5863 A1 describe la obtención de enzimas extracelulares a partir del caldo de fermentación de cepas de Bacillus. En este documento se describen experimentos para la eliminación de polímeros de la pared celular a través de una cromatografía de intercambio iónico, en particular en el transcurso de una preparación de amilasa. A este respecto se aplica en primer lugar la solución que contiene enzima y polímero sobre la columna, entonces en primer lugar se lava con tampón y a continuación se eluye con un medio de elución. Es decir la alfa-amilasa que va a purificarse se une en primer lugar al igual que las sustancias acompañantes al material de cromatografía y solo se separa por lavado a continuación aumentando la fuerza iónica.

El planteamiento inverso, dirigido a agotar las impurezas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la purificación de soluciones enzimáticas concentradas que contienen compuestos de Maillard

de color, que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una solución enzimática concentrada,

(b) separación de sólidos, en particular de proteínas extrañas y/o enzimas inactivas y

(c) separación de los compuestos de Maillard de color mediante adsorción a un intercambiador aniónico fuertemente básico, en el que el intercambiador aniónico fuertemente básico presenta grupos amonio cuaternarios como grupos funcionales, tiene una capacidad de intercambio de ,7 a 1,2 meq/ml, presenta un tamaño de poro efectivo de ,2 a ,7 mm y se basa en un polímero de plástico poroso como material de soporte, en el que el intercambiador aniónico fuertemente básico en un intervalo de pH de 5 - 9 presenta capacidad de intercambio máxima,

caracterizado porque en la solución enzimática concentrada mediante la etapa (b) no se obtiene más del 1 % en volumen de sólido y las proteínas enzimáticas permanecen en solución a lo largo de todo el procedimiento.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) se introduce un concentrado de ultrafiltración.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la etapa (a) se lleva a cabo por medio de un evaporador de capa fina.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque mediante la etapa (a) se prepara un concentrado enzimático, que no contiene más del 4 al 2 % en peso, preferentemente no más del 4,5 al 15 % en peso, de manera especialmente preferente no más del 5 al 1 % en peso de sustancia seca.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a continuación de la etapa (a) con la etapa (a) se lleva a cabo una desodorización de la solución enzimática concentrada.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo con un procedimiento de separación mecánico, preferentemente basado en la separación por la fuerza de la gravedad o por la fuerza centrífuga.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo con un separador, preferentemente un separador que funciona de manera continua, de manera especialmente preferente uno con descarga de muestra discontinua.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en la solución enzimática concentrada mediante la etapa (b) no se obtiene más del 1 % en volumen, preferentemente no más del ,7 % en volumen, de manera especialmente preferente no más del ,5 % en volumen de sólido.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) presenta capacidad de intercambio máxima en el intervalo de pH de 5 a 9, preferentemente de 6 a 8.

1. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) presenta como grupos funcionales grupos amonio cuaternarios sustituidos con al menos dos grupos alquilo, preferentemente con al menos dos grupos alquilo con 1 o 2 átomos de carbono, de manera opcional adicionalmente con un grupo hidroxilo que presenta 1 o 2 átomos de carbono.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) presenta como grupos funcionales grupos trimetil-amonio o dimetiletanol- amonio.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) presenta una capacidad de intercambio de ,8 a 1,1 meq/ml, preferentemente de ,9 a 1, meq/ml.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) presenta tamaños de poro efectivos de ,3 a ,6 mm, preferentemente de ,4 a ,5 mm.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el intercambiador aniónico fuertemente básico para la etapa (c) se basa en un copolímero de estireno-DVB.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la etapa (c) se lleva a cabo con un volumen de lecho de 1 a 1, preferentemente del 1,5 a 7, de manera especialmente preferente de 2 a 4.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la etapa (c) tiene lugar con un tiempo de permanencia promedio de ,1 a ,2 g, preferentemente de ,25 a ,1 g, de manera especialmente preferente de ,4 a ,6 g y de manera muy especialmente preferente de ,5 g de enzima por g de material de soporte y minuto.

17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la etapa (c), en particular la separación entre fracción de cabeza y producto objetivo y/o producto objetivo y fracción de cola se controla a través de la conductividad del eluato.

18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la etapa (c) tiene lugar con recirculación de al menos una parte de la fracción de cabeza y/o de la fracción de cola de la cromatografía de Intercambio iónico.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque a continuación de la etapa (c) en una etapa (d) mediante dilución se ajusta un valor de concentración más bajo.

2. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque a continuación de la etapa (c), dado el caso antes, después o al mismo tiempo que una dilución de acuerdo con la reivindicación 19, se añade un estabilizador, preferentemente al mismo tiempo con la etapa (d).

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque en el caso del estabilizador se trata de un poliol, preferentemente 1,2-propanodiol.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque el estabilizador se añade en un intervalo de cantidades del 4 al 7 % en volumen, preferentemente del 45 al 65 % en volumen, de manera especialmente preferente del 5 al 6 % en volumen del volumen final.

23. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque el producto de procedimiento se ajusta a un contenido de sustancia seca del 2 al 15 % en peso, preferentemente del 5 al 13 % en peso, de manera especialmente preferente del 8 al 12 % en peso.

24. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque el producto de procedimiento se ajusta a un valor de viscosidad de ,1 a ,2 Ns/m2 (de 1 a 15 mPas), preferentemente de ,1 a ,15 Ns/m2 (de 1 a 15 mPas), de manera especialmente preferente de ,1 a ,1 Ns/m2 (de 1 a 1 mPas) a 25

°C.

25. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque el producto de procedimiento se ajusta a un porcentaje de sedimento inferior al 1 % en volumen, preferentemente inferior al ,75 % en volumen, de manera especialmente preferente inferior al ,5 % en volumen.

26. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque se trata de una enzima que puede usarse técnicamente, preferentemente de una hidrolasa o una oxidorreductasa, de manera especialmente preferente de una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa o de una peroxidasa.

27. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque se trata de una proteasa, preferentemente una proteasa alcalina.

28. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque en particular en la etapa (c) se lleva a cabo a un valor de pH de 5 a 9, preferentemente de 6 a 8,5, de manera especialmente preferente de 7 a 8.

29. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 27 o 28, caracterizado porque el producto de la etapa (a) se ajusta a un valor de actividad de 6. a 9., preferentemente de 65. a 85., de manera especialmente preferente de 7. a 8. HPE por g.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque el producto final se ajusta a un valor de actividad de 15. a 5., preferentemente de 175. a 3., de manera especialmente preferente de 2. a 26. HPE por g.

31. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque se trata de una a-amilasa, preferentemente con un valor óptimo de pH alcalino.

32. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 26 o 31, caracterizado porque el producto de la etapa (a) se ajusta a un valor de actividad de 3. a 5. TAU por g, preferentemente de 35. a 45. TAU por g.

33. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 31 a 32, caracterizado porque el producto final se ajusta a un valor de actividad de 4. a 14., preferentemente de 6. a 12., de manera especialmente preferente de 8. a 1. TAU por g.

34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque se trata de una celulasa, preferentemente con un valor óptimo de pH alcalino.