Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras.

Un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra,

que comprende:

un primer reactivo que contiene un agente tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido carboxílico aromático, que puede lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en donde dicho tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y dicho tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y un esterol hidrogenado polioxietilenado, y

un segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico, en donde dicho colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I):

en donde:

R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo;

R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y

un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II):

en donde:

R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido.

Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras.

Campo técnico 5

La presente invención se refiere a un kit de reactivos y a un método para el análisis de células sanguíneas en una muestra biológica.

Técnica anterior 10

En el campo de los ensayos clínicos, el análisis de componentes de la sangre en muestras es muy importante cuando se diagnostican diversas enfermedades de los órganos circulatorios o similares de los sujetos. Dependiendo del tipo de enfermedad, el número de células sanguíneas concretas puede aumentar o disminuir, o en algunos casos aparecerán en la sangre periférica células de la sangre que normalmente no existen allí. 15

Recientemente, se han comercializado diversos contadores automáticos de células de la sangre en los que se aplican los principios de la citometría de flujo. Mediante el uso de tales contadores automáticos de células de la sangre, se pueden clasificar y contar automáticamente las células de la sangre de las muestras.

20 Normalmente, los leucocitos se pueden clasificar en cinco especies, a saber, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Entre éstos, el número de basófilos contenidos en las muestras de sangre es pequeño. Por lo tanto, la exactitud de la clasificación se puede mejorar mediante la comparación de la medición de los basófilos de muestras de sangre obtenidas usando un método que implica un tratamiento exclusivo para los basófilos con la medición de los basófilos obtenidos utilizando un método en el que los leucocitos se clasifican en cinco especies y 25 en la que los basófilos se miden en una medición. Los basófilos tienen la característica específica de que resultan menos dañados en comparación con otros tipos de leucocitos en condiciones ácidas. Mediante la utilización de esta característica, los basófilos se pueden distinguir de otros tipos de leucocitos mediante un tratamiento exclusivo para los basófilos, como se describe en la Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 61088896 (Documento de Patente 1) y en la Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 7294518 (Documento de Patente 2) . 30

La existencia de eritrocitos nucleados a veces causa problemas en la medición de los leucocitos. Los eritrocitos nucleados tienen núcleos. En la medición de los leucocitos, incluso cuando los eritrocitos son tratados para ser lisados, los núcleos de los eritrocitos nucleados continúan causando una señal similar a la generada por los leucocitos, produciendo errores por falsos positivos en la medición del número de leucocitos. Con el fin de eliminar 35 este efecto y para obtener el número exacto de leucocitos, se somete una muestra de sangre a un tratamiento, exclusivo para los eritrocitos nucleados, con el fin de medir el número de eritrocitos nucleados; el número de leucocitos en la misma muestra de sangre se mide por un método diferente; y a continuación se resta el número de eritrocitos nucleados del número de leucocitos obtenidos. La Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 10339729 (Documento de Patente 3) da a conocer la discriminación de los eritrocitos nucleados de los leucocitos 40 mediante la aplicación de un tratamiento exclusivo para eritrocitos nucleados a muestras de sangre.

Sin embargo, la necesidad de tratamientos exclusivos para los respectivos tipos de células de la sangre como se describe en los Documentos de Patente 1 a 3 anteriores para la clasificación de los basófilos o eritrocitos nucleados, requiere una gran cantidad de tiempo y además hace que los aparatos de medición sean complicados o de gran tamaño. Además, el requisito de múltiples reactivos exclusivos para los respectivos tipos de células sanguíneas da 45 como resultado un elevado coste global para el análisis de sangre. Por consiguiente, es preferible reducir el número de tratamientos exclusivos para determinados tipos específicos de células de la sangre.

Tanto los basófilos como los eritrocitos nucleados se pueden medir mediante el tratamiento de las muestras de sangre en condiciones ácidas. Por lo tanto, tanto los basófilos como los eritrocitos nucleados pueden ser medidos en 50 una medición cuando la muestra de sangre se trata en condiciones ácidas. La Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 2002148261 (Documento de Patente 4) describe un método en el que los basófilos y los eritroblastos (eritrocitos nucleados) se pueden medir mezclando una muestra con una solución acuosa que contiene un tensioactivo y un agente de lisis de los eritrocitos, lo que permite que los leucocitos y las células anormales estén en un estado adecuado para la tinción, añadiendo un agente de tinción que contiene un colorante fluorescente para 55 teñir las células y, posteriormente, midiendo la intensidad de fluorescencia y la intensidad de la luz dispersada con un citómetro de flujo.

Descripción de la invención 60

Problemas que va a resolver la invención

Sin embargo, utilizando el método descrito en el documento JP 2002148261 (Documento de Patente 4) , los basófilos no se separan bien de los otros tipos de leucocitos, es decir, distintos de los basófilos, especialmente en una muestra de sangre para la cual ha transcurrido un lapso de tiempo después de su recogida, como ocurrirá en 65 algunos casos.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un kit de reactivos y un método para la medición de una muestra que permiten una discriminación más clara y un recuento de eritrocitos nucleados y basófilos de otros tipos de leucocitos de la muestra.

Medios para resolver los problemas

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra, que comprende:

un primer reactivo que contiene un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido carboxílico 10 aromático, que pueden lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en donde el tensioactivo catiónico es un tipo de una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y el tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, un polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado 15 polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y un esterol hidrogenado polioxietilenado, y un segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir el ácido nucleico, en donde el colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I) :

en donde:

R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo; 25

R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II) : 30

en donde:

R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;

y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, siempre que uno de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 puede formar una sal, siempre que cualquiera de los grupos ácido que pueden estar presentes en R7 a R12 sea un grupo del que se haya liberado un protón. 5

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar una muestra que comprende las siguientes etapas:

lisis de los eritrocitos de la muestra y dañado de la membrana celular de las células de la sangre de manera que un colorante fluorescente pueda penetrar a través de la misma, en virtud del primer reactivo anterior, y la 10 tinción de las células dañadas en virtud del segundo reactivo anterior, aplicación de luz a las células teñidas para obtener información de la luz dispersada e información de la fluorescencia, y clasificación y recuento de los basófilos y/o eritrocitos nucleados en la muestra basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia. 15

Efecto de la invención

De acuerdo con la presente invención, los eritrocitos nucleados y los basófilos pueden ser más claramente discriminados de otras células de la sangre y se pueden contar incluso en la muestra de sangre para la cual ha 20 transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, lo que permite ensayos y diagnósticos más precisos de las enfermedades. La presente invención hace que sea posible contar eritrocitos nucleados... [Seguir leyendo]

1. Un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra, que comprende:

un primer reactivo que contiene un agente tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido 5 carboxílico aromático, que puede lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en donde dicho tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y dicho tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y 10 un esterol hidrogenado polioxietilenado, y un segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico, en donde dicho colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I) :

en donde:

R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo; 20

R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II) : 25

en donde:

R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;

y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, a condición de que uno cualquiera de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 puede formar una sal, siempre que cualquiera de los grupos ácido que puede presente en R7 a R12 sea 5 un grupo del que se haya liberado un protón.

2. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 en la fórmula general (II) es un grupo sulfónico.

3. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 en la fórmula general (II) es un grupo de una sal de metal alcalino.

4. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido carboxílico aromático es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido salicílico, ácido ftálico, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, ácido 15 aminobenzoico y una sal del mismo.

5. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el pH del primer reactivo es ácido.

6. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer reactivo comprende un agente 20 tamponador que tiene un pKa en el intervalo de pH 2, 0 a 4, 5.

7. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el agente tamponador es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido diglicólico, ácido malónico y ácido succínico. 25

8. Un método para analizar una muestra que comprende los siguientes pasos:

lisar los eritrocitos de la muestra y dañar la membrana celular de las células de la sangre de manera que un colorante fluorescente pueda penetrar a través de la misma, en virtud del primer reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, y teñir las células dañadas en virtud del segundo reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, 30

aplicar la luz a las células teñidas para obtener información de la luz dispersada e información de la fluorescencia y clasificar y contar los basófilos y eritrocitos nucleados de la muestra basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal y los eritrocitos nucleados de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde la información de la luz dispersada es la información 40 de la luz dispersada frontal, y los basófilos de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz información dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral, y los basófilos de la muestra se 45 cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral en la etapa de clasificación y recuento.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los leucocitos de la muestra se clasifican y se cuentan adicionalmente basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal y los leucocitos de la muestra se clasifican y se cuentan basándose en la información de la 5 luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.