Insectos de especies de Anopheles asépticos, esporozoitos de especies de Plasmodium asépticos obtenidos a partir de los mismos y una vacuna que comprende esporozoitos de especies de Plasmodium asépticos.

Mosquitos Anopheles libres de contaminación con microorganismos,

desarrollados en un entorno estéril, en donde los mosquitos se desarrollan a partir de huevos con la superficie esterilizada y se les proporciona aire filtrado, agua estéril y una nutrición estéril apropiada para la etapa de desarrollo durante la metamorfosis de huevo a adulto,

en donde dichos mosquitos, después de haber alcanzado la madurez, se infectan con parásitos Plasmodium, en donde la infección es el resultado de la alimentación de los mosquitos con un alimento estéril a base de sangre de gametocitos infecciosos procedente de una estación de alimentación de alimento a base de sangre;

en donde dichos parásitos se seleccionan del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. ovale, y R. malariae;y en donde los esporozoitos de Plasmodium pueden obtenerse a partir de los mosquitos y en donde dichos esporozoitos de Plasmodium son adecuados para la producción de una vacuna para su uso en seres humanos.

Insectos de especies de Anopheles asépticos, esporozoitos de especies de Plasmodium asépticos obtenidos a partir de los mismos y una vacuna que comprende esporozoitos de especies de Plasmodium asépticos Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a mosquitos Anopheles y a esporozoitos de Plasmodium así como a vacunas como se define en las reivindicaciones. Adicionalmente se describen aparatos y métodos para la producción de cepas de insectos (por ejemplo, mosquitos Anopheles) que tienen propiedades deseadas tales como hipoalergenecidad e hiperinfectividad. También se divulgan métodos para producir una cepa de un parásito que puede resistir a la criopreservación a temperaturas cercanas a la congelación. La presente invención también se refiere a aparatos y métodos para la inyección de una vacuna de parásitos atenuada. La presente invención permite la producción de parásitos y mosquitos Anopheles que carecen de contaminación por agentes biológicos no deseados tales como bacterias y otros microorganismos. Los aparatos divulgados en el presente documento proporcionan la reconstrucción de ciclos de vida parasitarios complejos asépticamente, de modo que se impida la contaminación bien del parásito o del hospedador vector insecto con agentes biológicos no deseados. También se divulgan métodos para la producción de una vacuna atenuada del esporozoito de Plasmodium que es estable a temperaturas criogénicas relativamente superficiales. También se divulgan aparatos para la administración de vacunas en cantidades de micro-bolos.

Descripción de los antecedentes La malaria es la enfermedad parasitaria más devastadora, y como tal representa uno de los problemas sanitarios públicos más importantes en todo el mundo. De acuerdo con los expertos en el campo, la malaria infecta a 300 millones de personas y mata hasta 3 millones de personas al año. Una vacuna para la malaria reduciría drásticamente el impacto de esta peligrosa enfermedad.

Los agentes causantes de la malaria son diversas especies del género eucariota Plasmodium, incluyendo Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae. Estos parásitos tienen un ciclo de vida muy complejo que implica hospedadores tanto vertebrados como invertebrados. La forma infectiva de vertebrados del parásito (esporozoitos) está presente en las glándulas salivares de los mosquitos (normalmente del género Anopheles) y los esporozoitos se transfieren a seres humanos durante la alimentación de los mosquitos. En el hospedador humano, los esporozoitos inicialmente infectan las células del hígado y eventualmente los eritrocitos. Esta infección da como resultado una enfermedad que es potencialmente letal para los infectados.

Las estrategias profilácticas actuales contra la malaria incluyen el uso de fármacos, incluyendo cloroquina, mefloquina y atovaquona/proguanil. Sin embargo, recientemente se han observado múltiples cepas resistentes a fármacos de Plasmodium. Además, se piensa que la aparición de cepas resistentes a fármacos de malaria está promovida por el uso de estos fármacos profilácticos antimalaria. Por consiguiente, deben abordarse esfuerzos significativos para desarrollar una vacuna para la malaria.

Hay algunas indicaciones en la bibliografía científica de que una vacuna para la malaria podría ser eficaz. Con respecto a una vacuna de esporozoitos completa metabólicamente activa no replicante (atenuada) , Nussenzweig y colaboradores (Nature 216: 160-162; 1967) publicaron esa inmunización de ratones con esporozoitos de Plasmodium berghei atenuados con radiación. Estos estudios con roedores proporcionaron el impulso para estudios en seres humanos, y durante los años 1970, Cylde, Rieckmann y colaboradores (Cly de et al.; Am. J. Med. Sci. 266: 169-177; 1973; Cylde et al. Am. J. Med. Sci. 266: 398-401; 1973; Rieckmann et al. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.

68: 258-259; 1974) dirigieron estudios limitados que establecieron que la inmunización de voluntarios humanos con las picaduras de mosquitos irradiados portadores de esporozoitos de Plasmodium falciparum en sus glándulas salivares protegerían a los voluntarios contra una exposición con esporozoitos completamente infecciosos de Plasmodium falciparum. Hoffman y Luke (Hoffman et al.; J. Infect. Dis. 185: 1155-1164; 2002) establecieron el potencial completo de esta estrategia describiendo los resultados de una experiencia clínica de 10 años con inmunizaciones con el mosquito vivo y exposiciones, y combinaron sus resultados con todos los informes clínicos publicados de la inmunización de seres humanos con esporozoitos de Plasmodium irradiados.

Los 3 puntos siguientes resumen los descubrimientos más importantes: 1) Trece de 14 voluntarios inmunizados por las picaduras de más de 1000 mosquitos irradiados infectados se protegieron contra el desarrollo de infección por P. faciparum en la fase eritrocitaria cuando se expusieron a las 10 semanas de su última inmunización primaria; 2) Cinco de 6 de los 14 voluntarios (1) anteriores cuando se expusieron de 23 a 42 semanas (23, 36, 39, 41 y 42 semanas) después de su última inmunización primaria o secundaria se protegieron contra la exposición experimental; y 3) Siete de siete exposiciones heterólogas (inmunizados con una cepa de P. falciporum y expuestos con otra cepa de P. facilparum) en cuatro individuos se asoció con protección completa.

A partir de esto, se demostró que la protección podía conseguirse en más del 90 % de los sujetos inmunizados, duró al menos 10 meses, y se demostró protección entre cepas cruzadas (heteróloga) . Por primera vez, se demostró la eficacia verdadera de esta estrategia de vacuna experimental. Aunque este estudio demostró la viabilidad de una vacuna de la malaria atenuada, se consideró por muchas razones que no era práctica para inmunizar grandes cantidades de individuos susceptibles empleando las picaduras de mosquitos infectados irradiados.

Un impedimento técnico para el desarrollo de una vacuna clínicamente relevante es la producción de esporozoitos asépticos que están libres de contaminación por agentes biológicos no deseados. Actualmente, no es posible producir esporozoitos de Plasmodium falciparum usando un proceso in vitro. Por tanto, los esporozoitos de Plasmodium falciparum deben obtenerse a partir de los tejidos de mosquitos Anopheles hembra infectados. Sin embargo, se sabe bien que los mosquitos silvestres y los criados en insectarios están altamente contaminados con agentes biológicos no deseados incluyendo bacterias, mohos y hongos. Esta contaminación impide en gran medida el uso de parásitos derivados de mosquitos en una vacuna clínicamente relevante adecuada de cara a una concesión de licencia reguladora. Un aparato y método para producir mosquitos Anopheles asépticos para la producción in vivo de esporozoitos de Plasmodium falciparum es una etapa crítica en el desarrollo de una vacuna de esporozoitos atenuada aceptable desde una perspectiva tanto clínica como reguladora.

La contaminación de mosquitos con agentes biológicos no deseados puede originarse de diversas fuentes en el ciclo de vida del mosquito. La superficie de los huevos del mosquito puede contaminarse durante la oviposición desde el tracto genital y los ovipositores del mosquito hembra. Las larvas pueden tener microbios en su tracto gastrointestinal y membrana peritrófica durante la metamorfosis de larvas a pupas y a mosquitos adultos. Además, factores ambientales múltiples, incluyendo el hábitat acuático de las larvas, el entorno externo del mosquito adulto, y la piel contaminada de un animal de la cual se alimenta el mosquito, pueden contribuir a la contaminación de los mosquitos y por tanto del parásito Plasmodium.

Durante décadas, los esporozoitos no asépticos se han obtenido rutinariamente a partir de mosquitos de Anopheles infectados para fines de investigación usando técnicas laboriosas. Existen múltiples inconvenientes para esta estrategia convencional. Dado que todo el proceso se realiza en condiciones no estériles, la preparación de los esporozoitos se contamina normalmente con microbios. Aunque los esporozoitos pueden purificarse parcialmente mediante diversas técnicas, la contaminación del producto resultante hace que este sea inadecuado para el uso del desarrollo de una vacuna para uso en seres humanos. Las vacunas contaminadas con microbios pueden producir una infección iatrogénica de una naturaleza grave tanto en seres humanos como en animales. Además, los procesos de la técnica anterior para la cría de mosquitos no asépticos son laboriosos y requieren múltiples manipulaciones directas de los mosquitos durante su ciclo de vida.

Por consiguiente, una de las limitaciones en la producción... [Seguir leyendo]

1. Mosquitos Anopheles libres de contaminación con microorganismos, desarrollados en un entorno estéril, en donde los mosquitos se desarrollan a partir de huevos con la superficie esterilizada y se les proporciona aire filtrado, agua estéril y una nutrición estéril apropiada para la etapa de desarrollo durante la metamorfosis de huevo a adulto, en donde dichos mosquitos, después de haber alcanzado la madurez, se infectan con parásitos Plasmodium, en donde la infección es el resultado de la alimentación de los mosquitos con un alimento estéril a base de sangre de gametocitos infecciosos procedente de una estación de alimentación de alimento a base de sangre;

en donde dichos parásitos se seleccionan del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. ovale, y R. malariae;y en donde los esporozoitos de Plasmodium pueden obtenerse a partir de los mosquitos y en donde dichos esporozoitos de Plasmodium son adecuados para la producción de una vacuna para su uso en seres humanos.

2. Esporozoitos de Plasmodium, libres de contaminación con microorganismos, que pueden obtenerse o que se 15 obtienen a partir de los mosquitos de la reivindicación 1.

3. Los esporozoitos de Plasmodium de la reivindicación 2, en los que dicha especie de Plasmodium es P. falciparum.

4. Una vacuna humana preparada utilizando los esporozoitos de Plasmodium de la reivindicación 2. 20

5. La vacuna humana de la reivindicación 4, que es una vacuna atenuada a base de esporozoitos de Plasmodium.