Inmunoensayo de inmunotransferencia Western que usa una membrana de inmunotransferencia hidrófila, de alta capacidad de unión a proteínas, de baja fluorescencia.

Un ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western para detectar proteínas elegidas en una muestra de proteínas,

que comprende:

separar electroforéticamente dichas proteínas elegidas de dicha muestra de proteínas;

transferir las proteínas elegidas separadas a un sustrato polimérico poroso de fluoropolímero que tiene un tamaño medio de los poros entre 0,001 y 10 micras, su superficie revestida con un revestimiento polimérico reticulado hidrófilo que tiene una capacidad de unión a proteínas cuando se mide mediante un análisis de unión a IgG de 250- 325 μg/cm2 que comprende acrilamida y metilenbisacrilamida, en donde los niveles medios de monómeros extraíbles del sustrato revestido, cuando se determinan mediante HPLC, están por debajo de 0,02 μg/cm2 para la acrilamida y por debajo de 0,15 μg/cm2 para la metilenbisacrilamida, en donde la concentración de sólidos totales de monómeros de acrilamida, monómeros de bisacrilamida y un fotoiniciador UV está entre 0,90% y 1,10% en peso, y la concentración conjunta de monómeros de la solución de monómeros reaccionantes de monómeros de acrilamida:metilenbisacrilamida usada para revestir dicha superficie está entre 0,5% y 1,5% en masa, y además en donde la cantidad de monómeros de acrilamida está entre 0,30% y 0,60% en peso, la cantidad de monómeros de bisacrilamida está entre 0,30% y 0,60% en peso, y la cantidad del fotoiniciador UV está entre 0,01% y 0,20%; bloquear dicho sustrato para evitar la unión no específica de anticuerpos a dicha superficie del sustrato; incubar dicho sustrato con un anticuerpo primario capaz de unirse a dichas proteínas elegidas;

incubar dicho sustrato con un anticuerpo secundario marcado capaz de complejarse con la enzima de dicho anticuerpo primario para proporcionar una señal medible; y

detectar dicha señal mediante detección visual, quimioluminiscente o fluorescente

Inmunoensayo de inmunotransferencia Western que usa una membrana de inmunotransferencia hidrófila, de alta capacidad de unión a proteínas, de baja fluorescencia "Inmunotransferencia" o "inmunoelectrotransferencia" se refiere al procedimiento usado para transferir muestras biológicas desde un gel a una membrana bajo la influencia de un campo eléctrico. El procedimiento requiere una membrana que puede inmovilizar muestras biomoleculares para la detección posterior. Esto plantea requisitos específicos sobre la membrana relacionados con la superficie específica, la porosidad y la capacidad de unión a proteínas.

La inmunotransferencia Western es una modificación de esta técnica que implica la inmovilización de proteínas sobre membranas antes de la detección usando anticuerpos monoclonales o policlonales. Antes de la inmovilización de proteínas sobre la membrana, las proteínas de la muestra se separan usando electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés) para separar proteínas naturales o desnaturalizadas. A continuación, las proteínas se transfieren o electroinmunotransfieren sobre una membrana, donde se sondan y finalmente se detectan usando anticuerpos específicos para una proteína elegida. Las membranas de inmunotransferencia Western típicamente están hechas de nitrocelulosa (NC) o poli (fluoruro de vinilideno) (PVDF, por sus siglas en inglés) . La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno puede permitir que se identifique una sola proteína entre una mezcla de proteínas compleja.

En resumen, la inmunotransferencia Western implica la aplicación de una muestra de proteínas (lisado) sobre un gel de poliacrilamida, la separación posterior de dicha mezcla compleja mediante electroforesis y la transferencia o 20 "electroinmunotransferencia" de proteínas separadas sobre una segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa o poli (fluoruro de vinilideno) (PVDF) . Después de la transferencia, la membrana se "bloquea" para evitar la unión no específica de anticuerpos a la superficie de la membrana. Muchas estrategias de marcaje o etiquetado de anticuerpos son conocidas por los expertos en la técnica. En los protocolos más simples, las proteínas transferidas se incuban o se complejan con un anticuerpo primario marcado con enzima que sirve como una sonda. 25 Después de bloquear lugares de unión no específica, un sustrato adecuado se añade para complejarse con la enzima, y juntos reaccionan para formar productos detectables cromogénicos, quimioluminiscentes o fluorogénicos que permiten la detección visual, por quimioluminiscencia o por fluorescencia, respectivamente. Los esquemas de detección más sensibles hacen uso de fenómenos quimioluminiscentes o fluorescentes. En la detección quimioluminiscente, un complejo enzima-sustrato produce emisiones ópticas detectables (quimioluminiscencia) . 30 Estas emisiones se registran y se miden usando detectores adecuados tales como dispositivos peliculares o fotónicos. La ausencia o presencia de señal indica si una proteína específica está presente en el lisado, y la intensidad de señal se relaciona con el nivel de la proteína de interés, que en algunos casos puede ser cuantificable.

El uso de membranas de nitrocelulosa está muy extendido en el trabajo de los ensayos de inmunodetección, particularmente en la inmunotransferencia Western. Esto se debe parcialmente a consideraciones históricas y se 35 debe parcialmente a la facilidad de uso. Las membranas de inmunotransferencia de nitrocelulosa no requieren una etapa de prehumedecimiento con líquido orgánico, un requisito para trabajar con membranas hidrófobas. Las membranas hidrófobas requieren una etapa de prehumedecimiento con alcohol seguida por una etapa de intercambio con agua (para la retirada del alcohol) , antes de montar dentro el dispositivos de transferencia de puntos. Las membranas intrínsecamente hidrófobas proporcionan un espacio de tiempo limitado para este 40 dispositivo; el potencial para que la membrana se seque es significativo. Una vez seca, la membrana no se puede rehumedecer a menos que se repita la secuencia de prehumedecimiento. Una vez que la membrana se pone en contacto con el gel, la retirada antes de la transferencia puede estropear efectivamente el gel y las muestras de proteína separadas contenidas. La etapa de prehumedecimiento consume mucho tiempo y puede dificultar considerablemente el volumen de trabajo. Una membrana hidrófila permanecerá húmeda durante un intervalo de 45 tiempo mayor, y se puede rehumedecer con agua si no se seca antes del montaje.

Las membranas de inmunotransferencia de nitrocelulosa son humedecibles con agua y muestran un comportamiento satisfactorio para la mayoría de las aplicaciones de inmunotransferencia. Pero la nitrocelulosa no es mecánicamente o químicamente tan estable como el PVDF. El PVDF mantendrá su integridad mecánica a lo largo de un gran espacio de tiempo, mientras que la NC se volverá frágil y se decolorará. Los puntos de la membrana de 50 PVDF se pueden separar de los anticuerpos y sondarse de nuevo. Los puntos de NC, no. La NC tiende a la oxidación al aire, momento en el que se puede volver peligrosa. Requiere una corriente residual separada, y cuando se desecha se debe mojar con un agente humectante, habitualmente agua.

Las membranas de inmunotransferencia de PVDF hidrófobas poseen una capacidad de unión a proteínas equivalente a las membranas de inmunotransferencia de NC, pero exhiben un comportamiento de 55 inmunotransferencia superior. Se pueden detectar concentraciones de muestra muy inferiores bajo las mismas condiciones en estas membranas de PVDF en comparación con la NC. Las membranas de PVDF hidrófobas de baja fluorescencia de fondo exhiben la misma detección de muestra mejorada mientras que permiten el uso de esquemas de detección fluorescentes.

Se sabe que la solicitud de patente internacional WO 03103814 - A1 (Millipore Corporation) describe medios o membranas porosos que tienen un revestimiento superficial que incluye un primer revestimiento de un terpolímero reticulado y un segundo revestimiento que comprende un copolímero o un terpolímero modificado con un grupo funcional hidrófilo o hidrófobo que tiene una combinación superior de propiedades, incluyendo propiedades adsortivas resistentes a biomoléculas termoestables, resistencia a soluciones alcalinas fuertes y bajos niveles de materia extraíble. Además, la solicitud de patente internacional WO 02087734 (Millipore Corporation) divulga medios o membranas porosos que tienen un revestimiento superficial que incluye un terpolímero reticulado que tiene una combinación superior de propiedades, incluyendo propiedades adsortivas resistentes a biomoléculas termoestables, resistencia a soluciones alcalinas fuertes y bajos niveles de materia extraíble. En algunas realizaciones preferidas, el medio poroso es una membrana porosa.

Por lo tanto, sería deseable proporcionar una membrana de PVDF hidrófila para ensayos de inmunodetección tales como inmunotransferencia Western, con características de comportamiento que lleguen a los límites inferiores de detección de muestras y baja fluorescencia de fondo que son característicos de las membranas de PVDF hidrófobas. Esta invención se dirige a estos requisitos.

Sumarioºeeºiaºinvención Rasgos esenciales y opcionales de la invención se indican en las reivindicaciones principales y subreivindicaciones adjuntas, respetivamente.

Los expertos en la técnica de la modificación de superficies con el propósito de alterar las energías superficiales de sustratos, y en particular con respecto a superficies destinadas a contacto con sistemas biológicos, estarán de acuerdo con que las modificaciones superficiales hidrófilas tradicionalmente exhiben un mal comportamiento de unión a proteínas. Las realizaciones divulgadas en la presente memoria se basan en el descubrimiento fortuito e inesperado de que polímeros espaciales derivados de ciertas mezclas de acrilamidas monómeras, y formados usando reacciones de polimerización por radicales libres, pueden dar lugar a modificaciones superficiales que no solo son hidrófilas, sino que también demuestran un alto nivel de unión a proteínas.

Mucha de la técnica anterior describe el uso de monómeros que contienen hidroxilo, habitualmente polímeros de acrilato que contienen ésteres carbonílicos, para producir modificaciones superficiales de membranas que tienen carácter hidrófilo y alta resistencia a la unión a proteínas. Sin embargo, se sabe que los polímeros procedentes de tales monómeros no son resistentes a soluciones alcalinas fuertes. Por ejemplo, una solución de hidróxido sódico 1, 0 normal hidrolizará los polímeros de acrilato que contienen carbonilo... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western para detectar proteínas elegidas en una muestra de proteínas, que comprende:

separar electroforéticamente dichas proteínas elegidas de dicha muestra de proteínas;

transferir las proteínas elegidas separadas a un sustrato polimérico poroso de fluoropolímero que tiene un tamaño medio de los poros entre 0, 001 y 10 micras, su superficie revestida con un revestimiento polimérico reticulado hidrófilo que tiene una capacidad de unión a proteínas cuando se mide mediante un análisis de unión a IgG de 250325 μg/cm2 que comprende acrilamida y metilenbisacrilamida, en donde los niveles medios de monómeros extraíbles del sustrato revestido, cuando se determinan mediante HPLC, están por debajo de 0, 02 μg/cm2 para la acrilamida y por debajo de 0, 15 μg/cm2 para la metilenbisacrilamida, en donde la concentración de sólidos totales de monómeros de acrilamida, monómeros de bisacrilamida y un fotoiniciador UV está entre 0, 90% y 1, 10% en peso, y la concentración conjunta de monómeros de la solución de monómeros reaccionantes de monómeros de acrilamida:metilenbisacrilamida usada para revestir dicha superficie está entre 0, 5% y 1, 5% en masa, y además en donde la cantidad de monómeros de acrilamida está entre 0, 30% y 0, 60% en peso, la cantidad de monómeros de bisacrilamida está entre 0, 30% y 0, 60% en peso, y la cantidad del fotoiniciador UV está entre 0, 01% y 0, 20%;

bloquear dicho sustrato para evitar la unión no específica de anticuerpos a dicha superficie del sustrato;

incubar dicho sustrato con un anticuerpo primario capaz de unirse a dichas proteínas elegidas;

incubar dicho sustrato con un anticuerpo secundario marcado capaz de complejarse con la enzima de dicho anticuerpo primario para proporcionar una señal medible; y

detectar dicha señal mediante detección visual, quimioluminiscente o fluorescente.

2. El ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western según la reivindicación 1, en el que el nivel medio de carbono orgánico total de dicho sustrato polimérico poroso está por debajo de 1, 5 μg/cm2.

3. El ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato polimérico poroso tiene un valor de fluorescencia de fondo, y en el que dicho sustrato modificado con dicho revestimiento polimérico exhibe una fluorescencia de fondo de dos veces la de dicho valor de fluorescencia de fondo del sustrato bajo condiciones de medida idénticas.

4. El ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de fluoropolímero comprende poli (fluoruro de vinilideno) .

5. El ensayo de inmunodetección por inmunotransferencia Western según la reivindicación 1, en el que la relación de acrilamida a metilenbisacrilamida es 1:1 (masa/masa) .

Resultados correspondientes a las condiciones de prueba proporcionadas en la Tabla 1. Resultados correspondientes a las condiciones de prueba proporcionadas en la Tabla 2.

Resultados correspondientes a las condiciones de prueba proporcionadas en la Tabla 3.