Inmunoensayo de doble reconocimiento para la deteccion de anticuerpos.

El inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos específicos de un antígeno diana en una muestra,

en donde el antígeno diana es un virus del género Arterivirus y en concreto, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos específicos de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador; y detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador. El inmunoensayo puede utilizarse, entre otras aplicaciones, en el diagnóstico do infecciones causadas por dicho virus con elevada sensibilidad y especificidad.

INMUNOENSAYO DE DOBLE RECONOCIMIENTO PARA LA DETECCIÓN

DE ANTICUERPOS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona, en general, con un inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos en una muestra, de elevada especificidad y sensibilidad. La invención también se relaciona con un kit que comprende los componentes necesarios para llevar a cabo dicho inmunoensayo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un inmunoensayo es un ensayo basado en la especificidad de la unión antígeno- anticuerpo que permite detectar, y, opcionalmente, cuantificar, antígenos o anticuerpos. Los inmunoensayos pueden clasificarse en inmunoensayos que utilizan reactivos (antígenos o anticuerpos) no-marcados y los inmunoensayos que utilizan reactivos marcados en los cuales el reactivo (antígeno o anticuerpo) está marcado con un marcador, tal como un isótopo radiactivo, una enzima, un fluoróforo o una sustancia implicada en una reacción (quimio)luminiscente, dando lugar a los denominados radioinmunoensayos (e.g., RIA, IRMA), inmunoensayos enzimáticos (e.g., EMIT, CEDIA, ELISA), fluoroinmunoensayos (e.g., FPIA, SLFIA, FETI, DELFIA) o luminoinmunoensayos, respectivamente.

Entre los inmunoensayos que utilizan reactivos marcados se encuentran los inmunoensayos homogéneos y los inmunoensayos heterogéneos; estos últimos comprenden la realización de una o más etapas de separación del antígeno o anticuerpo no unido al otro miembro del par de unión (antígeno o anticuerpo) el cual, en general, estará unido a una fase sólida o soporte, por ejemplo, microplacas, partículas magnéticas, membranas de nitrocelulosa, etc. Asimismo, dependiendo del diseño del ensayo, los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no competitivos, dependiendo de si el reactivo (antígeno o anticuerpo) marcado se añade en cantidad limitada o en exceso, respectivamente.

Los inmunoensayos permiten identificar antígenos (técnicas directas) o bien anticuerpos frente a un antígeno (técnicas indirectas). Entre estas técnicas indirectas se encuentran los inmunoensayos indirectos y los inmunoensayos de bloqueo o competición. Los inmunoensayos indirectos, a pesar de tener una elevada sensibilidad,

presentan problemas de especificidad por los falsos positivos obtenidos, normalmente por los problemas de fondo inespecífico. Además, no permiten detectar IgMs porque normalmente se usan anticuerpos anti-IgGs, por lo que no detectan a los animales positivos hasta las 2-3 semanas post-infección o post-vacunación. Los inmunoensayos de bloqueo o competición, en general, son más específicos que los inmunoensayos indirectos pero menos sensibles.

Debido a la especificidad y sensibilidad de los inmunoensayos, se han desarrollado numerosos inmunoensayos para diversas aplicaciones, tanto para su empleo en el análisis de muestras medioambientales o de alimentos como con fines de diagnóstico. Entre las infecciones causadas por virus animales que pueden ser diagnosticadas mediante inmunoensayos se encuentran, a modo ilustrativo, la Lengua Azul y el Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS).

La Lengua Azul es una enfermedad causada por el virus de la Lengua Azul (BTV, del inglés "Blue Tongue Virus"), un arbovirus que infecta de forma natural a rumiantes domésticos y salvajes, camélidos y algunos otros herbívoros, tales como elefantes, aunque la enfermedad afecta casi exclusivamente a las ovejas, originando cursos clínicos agudos o subagudos. En vacas y cabras, la enfermedad clínica es rara, y, cuando se presenta, es mucho más suave que en ovejas. La oveja afectada puede morir después de una enfermedad aguda o crónica, o puede recuperarse con la pérdida de peso y/o roturas de lana. Actualmente existen 24 serotipos de BTV reconocidos. Las pruebas recomendadas para la detección de anticuerpos y serogrupos específicos de BTV incluyen la inmunodifusión en gel de agar y un ELISA competitivo, preferentemente éste último debido a su mayor exactitud y adaptación a rápidas pruebas convencionales de laboratorio y tecnología de lectura. La prueba recomendada para detectar anticuerpos de serotipos específicos del BTV es el test de neutralización.

El virus causante del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV, del inglés "Porcine Reproductive and Respiratory Virus") es un arterivirus que causa el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS). Dicho virus puede causar problemas reproductivos importantes en cerdas adultas que pueden terminar en abortos así como problemas respiratorios, entre otros, en cerdos neonatos o en cerdos en desarrollo. La patente europea EP 952219 B1 describe un método para el diagnóstico de PRRSV que comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con una proteína de fusión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de la

proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV fusionada a un fragmento de la proteína del gen 10 del fago T7.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Ahora se ha observado, sorprendentemente, que la adición de un conjugado que comprende un antígeno y un marcador a un complejo antígeno-anticuerpo aumenta la especificidad y sensibilidad de un inmunoensayo para la detección de anticuerpos específicos de dicho antígeno.

El inmunoensayo proporcionado por esta invención ha sido denominado "inmunoensayo de doble reconocimiento" ya que comprende el reconocimiento y unión de dos unidades del antígeno diana al anticuerpo específico de dicho antígeno diana, uno de ellos formando parte de un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador. Dicho inmunoensayo ha sido validado en sueros de referencia para la detección de anticuerpos específicos del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) (Ejemplo 1) y posee una elevada especificidad y sensibilidad.

Dicho inmunoensayo de doble reconocimiento se puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos de organismos patógenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la infección causada por un organismo, tal como un organismo patógeno en un sujeto susceptible de ser infectado por dicho organismo, así como para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano, o para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de alérgenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de una reacción alérgica frente a dicho alérgeno en dicho sujeto, preferentemente, en un ser humano.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra, en el que dicho antígeno diana es un virus del género Arterivirus, que comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo

antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, y detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo- antígeno/marcador.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra, en el que dicho antígeno diana es el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), que comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, y detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende un soporte que comprende un antígeno diana, en el que dicho antígeno diana es un virus del género Arterivirus,

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende un soporte que comprende un antígeno diana, en el que dicho antígeno diana es el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) y un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se relaciona con un inmunoensayo, en adelante inmunoensayo de la invención, para detectar un anticuerpo específico... [Seguir leyendo]

1. Un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra en el que dicho antígeno diana es un virus del género Arterivirus, que comprende:

a) poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo;

b) añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador; y

c) detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.

2. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicho virus esel virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV)

3. Un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra en el que dicho antígeno diana es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende:

a) poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo;

b) añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador; y

detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.

4. Inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 3, en el que dicha muestra sospechosa de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana es una muestra biológica.

5. Inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 3, en el que dicho marcador es una enzima, un compuesto fluorescente o fluoróforo, un compuesto (quimio)luminiscente o un elemento radiactivo.

6. Inmunoensayo según la reivindicación 5, en el que dicho marcador es una peroxidasa.

7. Inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 3, en el que dicho inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático, un fluoroinmunoensayo, un luminoinmunoensayo o un radioinmunoensayo.

8. Inmunoensayo según la reivindicación 7, en el que dicho inmunoensayo es un ELISA.

9. Inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 3, en el que dicho antígeno diana está inmovilizados sobre un soporte.

10. Inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 3, que comprende, además, cuantificar la cantidad de anticuerpos específicos de dicho antígeno diana presentes en dicha muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.

11. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV y dicho conjugado comprende dicha proteína de fusión que comprende la proteína N de PRRSV conjugada a una peroxidasa.

12. Un kit que comprende:

(i) un soporte que comprende un antígeno diana, en el que dicho antígeno diana es un virus del género Arterivirus; y

(ii) un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.

13. Kit según la reivindicación 12, que comprende, además, unos medios para revelar dicho marcador.

14. Kit según la reivindicación 12, en el que el antígeno del Arterivirus es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

15. Uso de un kit según la reivindicación 12, para detectar, y si se desea, cuantificar anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.

16. Un kit que comprende:

(i) un soporte que comprende un antígeno diana, en el que dicho antígeno diana es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); y

(ii) un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.

17. Kit según la reivindicación 16, para diagnosticar la infección causada por el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que comprende un soporte que comprende un antígeno de PRRSV y un conjugado que comprende dicho antígeno de PRRSV conjugado a un marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno de PRRSV-anticuerpo-antígeno de PRRSV/marcador.

18. Kit según la reivindicación 17, en el que dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV y dicho conjugado comprende dicha proteína de fusión que comprende la proteína N de PRRSV conjugada a una peroxidasa, y comprende, además, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).

19. Uso de un kit según la reivindicación 16, para detectar, y si se desea, cuantificar anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

N.° solicitud:

Fecha de presentación de la solicitud: 07.12.2009 Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

© Int. Cl.: G01N33/533 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

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Documentos citados

Rei vi nd icaciones afectadas

FERRIN NEAL Fl et al. Validation of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology Mayo 2004 (05.2004) VOL: 11 No: 3 Págs: 503-514 ISSN 1071^Í12X (ISSN print).

CFIEN S et al. Double-antigen sandwich ELISA for detection of antibodies to SARS-associated coronavirus in human serum. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 20050801 Springer, Berlin, DE 01.08.2005 VOL: 24 No: 8 Págs: 549-553 ISSN 1435-4373 Doi: doi: 10.1007/s10096-005-1378-7.

SEUBERLICFI T et al. Nucleocapsid Proteln-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection and Differentiation of Antibodies Against European and North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, 20021101 AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US 01.11.2002 VOL: 9 No: 6 Págs: 1183-1191 ISSN 1071-412X Doi: do¡:10.1128/CDLI.9.6.1183-1191.2002.

WO 2006093797 A2 (MJ BIOLOG INC et al.) 08.09.2006, reivindicaciones; figuras.

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Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escrita

P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud

E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud