Inhibidores de LOX y LOXL2 y usos de los mismos.

Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína similar a lisil oxidasa 2 (LOXL2),

en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se unen específicamente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 e inhiben la actividad enzimática de la proteína LOXL2, en donde la inhibición es no competitiva.

Inhibidores de LOX y LOXL2 y usos de los mismos

Antecedentes de la invención El cáncer es un grave problema de salud pública en los Estados Unidos y otros países desarrollados. Actualmente, una de cada cuatro muertes en los estados unidos se debe al cáncer. La terapia para el cáncer implica tratar a los pacientes con fármacos quimioterapéuticos para eliminar células tumorales. Sin embargo, los subconjuntos de células tumorales son frecuentemente resistentes a la terapia con fármacos y sobreviven y vuelven a formar poblaciones en los sitios de origen y en sitios metastásicos distantes, dando lugar a una recurrencia detectable de la enfermedad y a morbilidad. Muchas células tumorales de carcinoma que tienen las propiedades de capacidad invasiva y metastásica aumentadas, y resistencia a fármacos alterada, se cree que han sufrido una transformación morfológica que abarca o es similar a la EMT (transición epitelial-mesenquimal) . Las células que sufren EMT pierden las propiedades adhesivas normales de las células epiteliales y sufren un espectro de cambios que incluyen la pérdida de la expresión de E-cadherina y la expresión de marcadores mesenquimales, una motilidad aumentada, una invasividad aumentada, y una resistencia aumentada a la muerte celular.

Las principales terapias para el cáncer son actualmente cirugía, radiación y quimioterapia. Las estrategias quimioterapéuticas, tales como antibióticos antitumorales, agentes alquilantes, compuestos de nitrosourea, alcaloides de la vinca, hormonas esteroideas, y antimetabolitos forman la mayoría de las terapias disponibles para los oncólogos. A pesar de los avances en el campo del tratamiento del cáncer, el cáncer sigue siendo un problema de salud importante.

La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos fuera de los capilares preexistentes, es una secuencia de eventos que es de importancia clave en una amplia variedad de procesos fisiológicos y patológicos. El crecimiento normal de tejidos, tal como el desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, y el ciclo menstrual, está caracterizado por la dependencia de la formación de nuevos vasos para el suministro de oxígeno y nutrientes así como la retirada de productos de desecho. Una gran variedad de enfermedades diferentes y no relacionadas también se asocian con la formación de nueva vasculatura. Entre determinadas patologías, hay afecciones en las que la angiogénesis es baja, y debe potenciarse para mejorar los estados de enfermedad. Más frecuentemente, sin embargo, la angiogénesis excesiva es una característica importante de varias patologías, incluyendo patologías caracterizadas o asociadas con una proliferación de células anormal o no controlada. Las patologías que implican una angiogénesis excesiva incluyen, por ejemplo, cánceres (tumores tanto sólidos como hematológicos) ,

enfermedades cardiovasculares (tales como aterosclerosis y restenosis) , inflamación crónica (artritis reumatoide, enfermedad de Crohn) , diabetes (retinopatía diabética) , psoriasis, endometriosis, glaucoma neovascular y adiposidad (3) . Estas afecciones pueden beneficiarse de la inhibición quimioterapéutica de la angiogénesis.

Hablando de manera general, el proceso angiogénico implica la proliferación y migración de un endotelio normalmente quiescente, la proteolisis controlada de la matriz pericelular, y la síntesis de nuevos componentes de matriz extracelular por los capilares en desarrollo. El establecimiento de nuevos contactos intra e intercelulares y la diferenciación morfológica de células endoteliales a redes tubulares de tipo capilar proporciona soporte para su posterior maduración, ramificación, remodelado y regresión selectiva para formar una red microvascular funcional elevadamente organizada. Las interacciones autocrinas, paracrinas y anficrinas del endotelio vascular con sus 45 componentes estromales circundantes, así como con las citocinas pro-angiogénicas y angiostáticas y factores de crecimiento que orquestan la angiogénsis fisiológica, normalmente están estrechamente reguladas tanto espacial como temporalmente.

La angiogénesis es crucial para el crecimiento de tejidos neoplásicos. Durante más de 100 años, se han observado los tumores más como tejidos vasculares que normales. Varios estudios experimentales han sugerido que tanto el crecimiento primario de tumores como la metástasis necesitan neovascularización. A diferencia del proceso bien orquestado descrito anteriormente para el crecimiento normal de tejidos, la angiogénesis patológica necesaria para el crecimiento activo de tumores es generalmente sostenida y persistente, siendo la adquisición inicial del fenotipo angiogénico un mecanismo común para el desarrollo de varios tipos de tumores sólidos y hematopoyéticos. Los 55 tumores que son incapaces de reclutar y mantener una red vascular permanecen normalmente durmientes como lesiones asintomáticas in situ. La metástasis también es dependiente de la angiogénesis: para que una célula tumoral metastatice de manera exitosa, generalmente tiene que lograra acceso a la vasculatura en el tumor primario, sobrevivir a la circulación, detenerse en la microvasculatura del órgano diana, salir de esta vasculatura, crecer en el órgano diana, e inducir la angiogénesis en el sitio diana. Por lo tanto, la angiogénesis parece ser necesaria al comienzo así como la compleción de la cascada metastásica.

La capacidad crítica de la angiogénesis para el crecimiento y la metástasis de neoplasias proporciona por lo tanto una diana potencial óptima para los esfuerzos quimioterapéuticos. Los agentes anti-angiogénicos adecuados pueden actuar directamente o indirectamente para influenciar la angiogénsis asociada a tumores ya sea retrasando su 65 aparición (es decir, bloqueando un "interruptor angiogénico") o bloqueando la neovascularización sostenida y focal que es característica de muchos tipos de tumores. Las terapias anti-angiogénsis dirigidas contra el endotelio

asociado al tumor y los múltiples procesos moleculares y celulares y dianas implicadas en la angiogénesis patológica sostenida se están evaluando activamente en cuanto a su seguridad y eficacia en múltiples ensayos clínicos. Sin embargo, ha habido un éxito limitado hasta la fecha en cuanto al descubrimiento y/o identificación de agentes antiangiogénicos seguros y/o eficaces.

La fibrosis es la acumulación anormal de tejido fibrótico que puede suceder como parte del proceso de curación de heridas en el tejido dañado. Dicho daño tisular puede ser el resultado de una lesión física, inflamación, infección, exposición a toxinas, y otras causas.

La fibrosis de hígado (hepática) , por ejemplo, sucede como parte de la respuesta de curación de heridas en la lesión hepática crónica. La fibrosis sucede como una complicación de la hemocromatosis, la enfermedad de Wilson, el alcoholismo, la esquistosomiasis, la hepatitis vírica, la obstrucción del conducto biliar, exposición a toxinas, y trastornos metabólicos. Esta formación de tejido cicatrizal se cree que representa un intento del cuerpo para encapsular al tejido lesionado. La fibrosis hepática está caracterizada por la acumulación de matriz extracelular que puede distinguirse cualitativamente de aquella en el hígado normal. Si no se controla, la fibrosis hepática progresa a cirrosis (definida por la presencia de nódulos encapsulados) , insuficiencia hepática, y la muerte.

Como se resume por Li y Friedman (Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999) , las estrategias terapéuticas actuales y propuestas para la fibrosis hepática incluyen la eliminación de la causa subyacente (por ejemplo, toxina o agente 20 infeccioso) , la supresión de la inflamación (usando, por ejemplo, corticoesteroides, antagonistas del receptor de IL-1, u otros agentes) , la regulación negativa de la activación de células estrelladas usando, por ejemplo, interferón gamma y antioxidantes) , la promoción de la degradación de la matriz, o la promoción de la apoptosis de células estrelladas. A pesar del progreso reciente, muchas de estas estrategias todavía se encuentran en etapa experimental, y las terapias existentes están dirigidas a la supresión de la inflamación más que a dirigirse a los procesos bioquímicos subyacentes. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de materiales y métodos para tratar la fibrosis, incluyendo la fibrosis hepática y pulmonar.

Los tejidos fibróticos se acumulan en el corazón y los vasos sanguíneos a causa de la hipertensión, de la enfermedad cardíaca hipertensiva, aterosclerosis, e infarto de miocardio. La presión sanguínea elevada, o 30 hipertensión, puede estar causada por varios factores y a menudo da lugar al desarrollo de la enfermedad coronaria... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína similar a lisil oxidasa 2 (LOXL2) , en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se unen específicamente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 6 e inhiben la actividad enzimática de la proteína LOXL2, en donde la inhibición es no competitiva.

2. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden una cadena pesada variable que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº : 1.

3. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden una cadena ligera variable que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº : 2.

4. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno están humanizados o son humanos.

5. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo el o fragmento están humanizados y comprenden las CDR de cadena pesada variable que tienen las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de GYAFTYYLIE (SEC ID Nº : 41) , VINPGSGGTNYNEKFKG (SEC ID Nº : 42) y NWMNFDY, respectivamente, y las CDR de cadena ligera variable que tienen las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de RSSKSLLHSNGNTYLY (SEC ID Nº : 57) , RMSNLAS (SEC ID Nº : 58) y MQH-LEYPYT (SEC ID Nº : 59) , respectivamente.

6. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 4 o 5, en donde el anticuerpo o el fragmento están humanizados y tienen una cadena pesada variable que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº : 25, 26, 27 o 28.

7. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 6, en donde la cadena pesada variable comprende la SEC ID Nº : 27.

8. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el anticuerpo o el fragmento están humanizados y tienen una cadena ligera variable que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº : 30, 31 o 32.

9. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 8, en donde la cadena ligera variable comprende la SEC ID Nº : 31.

10. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que compiten con un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº : 1 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº : 2 por la unión a LOXL2.

11. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el anticuerpo o el fragmento están marcados con un marcador terapéutico o un marcador diagnóstico.

12. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el anticuerpo o el fragmento están marcados con un marcador detectable.

13. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el anticuerpo o el fragmento son un Fv, un scFv, un Fab, un F (ab') 2, un anticuerpo diseñado por ingeniería genética,

o un anticuerpo monoclonal.

14. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en un método para reducir el crecimiento tumoral, reducir la metástasis, inhibir la angiogénesis, tratar la fibrosis o disminuir la formación de matriz extracelular.

15. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se usan en combinación con un segundo agente terapéutico.

16. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o un agente quimioterapéutico.

17. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha fibrosis es una fibrosis hepática, una fibrosis pulmonar, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca o escleroderma.

18. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha fibrosis pulmonar es fibrosis pulmonar idiopática (FPI) , alveolitis fibrosante criptogénica, neumonía intersticial fibrosante crónica, enfermedad pulmonar intersticial (ILD) , enfermedad pulmonar parenquimal difusa (DPLD) , enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o asma crónica.

19. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha fibrosis hepática es cirrosis, hepatitis viral crónica, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) , esteatohepatitis alcohólica (ASH) , esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , cirrosis biliar primaria (PBC) , cirrosis biliar o hepatitis autoinmune.

FIGURA 1 Enzimología de lisil oxidasa

Las enzimas LOX/L actúan por medio de un mecanismo de ping-pong que puede describirse mediante la cinética de Michaelis-Menten

FIGURA 2 Modos comunes de inhibición enzimática

Inhibición competitiva

• El inhibidor normalmente tiene similitud estructural con respecto al sustrato.

• Inhibición perceptible a bajas concentraciones de sustrato pero pueden superarse a altas concentraciones de sustrato.

Inhibición a competitiva

• El inhibidor se une en el sitio que esté disponible después de que el sustrato se una al sitio activo

• Inhibición más perceptible a alta concentración de sustrato

Inhibición no competitiva

• El inhibidor se une a un sitio que está lejos del sitio de unión del sustrato

• La inhibición relativa es la misma a todas las concentraciones de sustrato.

FIGURA 3

APN es un inhibidor no competitivo de LOXL2

FIGURA 4

Modos inhibición enzimática: LOXL2

Figura 5 LOXL2 extracelular: Localización y Función

A alta densidad celular, LOXL2 se secreta y detecta unida a la matriz y, en medio condicionado, un anticuerpo bloqueante se unirá covalentemente a todos los estados e inhibirá todas las actividades Figura 6 Anticuerpo anti-LOXL2 monoclonal murino

A. Cadena pesada variable

B. Cadena ligera variable

Figura 7 Anticuerpo anti-LOX

A. Cadena pesada variable

B. Cadena ligera variable 1

C. Cadena pesada variable 2

Figura 8

Anticuerpos anti-LOXL2: Actualización proteína Exploración B Evaluación de la actividad enzimática de LOXL2

Anticuerpo anti-LOXL2 designado AB0023

• Actividad inhibidora observada en 10 ml del material de la proporción en el ensayo enzimático

• La inhibición también se repetirá en ensayos basados en células

• El análisis de secuencia confirma que M01, M16, M19, M20 son idénticos

Figura 9 Anticuerpo anti-LOXL2 AB0023 y actividad enzimática

AB0023 es un inhibidor parcial de la actividad enzimática de LOXL2 con una CI50 aparente de ~30nM

Figura 10

Anticuerpo anti-LOXL2 AB0023: un inhibidor no competitivo

Figura 11 Anticuerpo anti-LOXL2 AB0023: Afinidad de unión y velocidad de disociación

Análisis usando el ProteOn 1 ug/ml de AB0023 (M20) inmovilizado en un chip Se aplicó LOXL2 en concentraciones variables al chip

6. 1 -1

• kon=1, 68 x l0Ms - 4 -1

• koff=1, 17 x l0s

•KD=0, 69 nM

• t1/2 =98, 7 min

El anticuerpo se une muy fuertemente y se libera muy despacio Kd estimada de diversos métodos 0, 1 – 1, 0 nM

Figura 12

Mapeo de los dominios de anticuerpo anti-LOXL2 AB0023

AB0023 se une al dominio SRCR 3-4

AB0023 se une al dominio SRCR 3-4

Figura 13

Anticuerpo anti-LOXL2 AB0023: Ensayos basados en células

• Inhibición consistente de la migración/invasión en colágeno I y colágeno IV, de sobrenadantes a través de 10 ml del material de la proporción y 100 ml de la proporción a mayor escala y material ascítico.

• También se observó inhibición parcial en el ensayo de adhesión celular

Sensibilidad a DDP en la línea celular MiaPaCa 2 en placas de CT tratadas CI50

Línea celular No tratado (uM) Anti-LOX (M64) (uM)

231 261, 8 ± 72, 3 242, 2 ± 14, 4

HT1080 207, 5 ± 6, 9 194, 2 ± 22, 7

MiaPaCa 2 664, 6 ± 112, 8 174, 7 ± 5, 7

BT549 384 ± 244, 3 197, 3 ± 28, 5