Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos.

Un polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 variante, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en relación con una región Fc de IgG1 silvestre,

de manera que:

(I) dicha región Fc variante de dicho polipéptido se une a:

(A) Fc γ RIIIA con una mayor afinidad, y

(B) Fc γ RIIB con una afinidad de unión equivalente o alterada;

en donde dichas afinidades de unión mayores, equivalentes o alteradas son en relación con las afinidades de unión exhibidas por dicho polipéptido a dicha Fcγ R que comprende una región Fc silvestre; y

(II) en donde dicha al menos una modificación de aminoácidos comprende una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina, y en la posición 396 con leucina;

en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el índice de la UE como en Kabat

Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos 1. Campo de la invención la presente invención se relaciona con moléculas, particularmente polipéptidos, más particularmente inmunoglobu linas (por ejemplo, anticuerpos) , que comprenden una región Fc variante, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en relación con una región Fc tipo silvestre, cuya región Fc variante se une a FcyRlIlA con una mayor afinidad, en relación con una molécula comparable que comprende la región Fc tipo silvestre. Las moléculas de la invención son particularmente útiles al impedir, tratar, o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno, o infección. Las moléculas de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno donde se desea una eficacia mejorada de la función celular efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por FcyR, por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa, y para mejorar la eficacia terapéutica de los anticuerpos terapéuticos cuyo efecto se media por ADCC.

2. Antecedentes de la invención 2.1 Receptores Fc y su papel en el sistema inmunológico La interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmunológico resulta en una amplia matriz de respuestas, que van desde funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, desgranulación de mastocilos, y fagocitosis a señales inmunomoduladoras tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunológicos a receptores especializados de superficie celular en las células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos y complejos inmunológicos resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores Fc. Los receptores Fc comparten dominios de unión de ligandO estructuralmente relacionados que median presumiblemente la señalización intracelular.

Los receptores de Fc, miembros de la superfamilia de proteínas de genes de inmunoglobulina, son glicoproteínas de superficie que pueden unir la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento en la cadena a del receptor Fc. Los receptores Fc se definen por su especificidad para los subtipos de inmunoglobulinas. Los receptores Fc para IgG se denominan como FcyR, para IgE como FER, y para IgA como FcaR. Diferentes células accesorias portan receptores Fe para anticuerpos de isolipo diferente, y el isolipo del anticuerpo determina qué células accesorias participarán en una respuesta determinada (revisado por Ravetch J.v. y otros 1991 , Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. y otros 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau 0.0. y otros 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2 (109) : 1611681 ; Ravetch J.V. y otros 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J. V. y otros, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J. V. 1994, Cell, 78 (4) : 553-60) . los diferentes receptores Fc, las células que los expresan, y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptado de humunobiolooy: The Immune System in Heallh and Disease, 4ta edición 1999, Elsevier Science UdlGarland PUblishing, Nueva York) .

Receptores Fcy

Cada miembro de esta familia es una glicoproteina de membrana integral, que posee los dominios extracelulares relacionados a un conjunto C2 de dominios relacionados con la inmunoglobulina, un único dominio de inmunoadsorción de membrana y un dominio intracitoplasmático de longitud variable. Existen tres FcyAs conocidos, designados FcyRI (CD64) , FcyRII (C032) , y FcyRIII (COI6) . l os tres receptores se codifican por genes distintos; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugieren que provinieron de un progenitor común quizás por la duplicación de genes.

FcyRI/ (C032)

Las proteínas FcyRII son glicoproteínas integrales de membrana de 40 KOa que se unen s610 la IgG complejada debido a una baja afinidad por el 19 monomérico Ig (106 MI¡. Este receptor FcyR es el más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, que incluyen monocilOS, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcyRII tiene sólo dos regiones similar a inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y de ahí una afinidad mucho menor por IgG que FcyRI. Existen tres genes FcyRII humanos (FcyR II-A, FcyRII-B, FcyRII-C) , todos los cuales unen 19G en agregados o complejos inmunológicos.

Las diferencias distintas dentro de los dominios citoplasmáticos de FcyRII-A y FcyRII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas para la ligación de los receptores. la diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la

señalización intracelular que conduce a la activación celular tales como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia las señales inhibidoras, por ejemplo, inhibición de la activación de células B.

Señalización a través de FcyRs 5

Tanto las señales de activación como inhibidoras se transducen a través de los FcyRs a continuación de la ligación. Estas funciones diametralmente opuestas resultan de las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor llamado motivo de ªctivación del inmmunoreceptor basado en lirosina (ITAMs) o motivos inhibitorios inmunorreceptores basados en tirosina (ITIMS) justifican las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas a estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos de FcyR que contiene ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras que los complejos que contienen ITIM solamente incluyen FcyRIIB.

Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. La agrupación FcyRIIA a través de complejos inmunológicos o reticulación de anticuerpo especifico sirve para agregar ITAMs junto con las quinasas asociadas al receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de ITAM sirve como sitio de acoplamiento para la quinasa Syk, cuya activación resulta en la activación de sustratos intermedios (por ejemplo, PI3K) . La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios.

El gen FcyRIIB se expresa en los linfocitos B; su dominio extracelular es 96 % idéntico a FcyRIIA y une complejos de IgG de una manera indistinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclase inhibidora de FcyR. Recientemente se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se liga junto con un activador FcyR, el ITIM en FcyRIIB se vuelve fosforilado y atrae el dominio SH2 del inosital polifostato S'·fosfatasa (SHIP) , que hidroliza mensajeros fosfoinositol liberados como una consecuencia de la activación de la tirosina quinasa mediada por FcyR que contiene ITAM, impidiendo de este modo la entrada de Ca++ intracelular. Así, la reticulación de FcyRIIB hace perder la respuesta de activación a la ligación de FcyR e inhibe la respuesta celular. La activación de células B, la proliferación de células B y la secreción de anticuerpos así se interrumpe.

TABLA l. ~DI~ I '1 ~f1I "" r.gionft Fo delsotipoJ _lrImunogIotIuIirwo

. ....

U..... F~I (C[) ¡.f, ) IgG I 10' 1. (' - FoyRll .... ¡CDll) IgG1.h lo" Ior' ':l""', o'" IvGlhla" .... '~..., ' ''' 19G! h 10" '" f oyRJl (CDI6) !gG15. 10" ...' Fa RI lrgE 1010 .... • '<GR' ICOI!) loA ' "..., 10f .., .,

TIpo '"'''''' -E"""..... """"'" do "-"..............co..... """"""-... ... ............. . """"". " M ""'" ""-== M;M " 10. Eos:nOIi~........ """'-fow Of1a1

E_do ......... "'-""--....._n_ ~i lnducaOn de ~ """'" "'-"" ............. ..""*' c., .o..;............•""""""'" Noc., .o..;...........•l a .. • • lnduccoOn de La ....... ............. c., .u.;............. -

2.2 Enfermedades de relevancia 2.2.1 Cáncer

Una neoplasia o tumor es una masa neoplásica que resulta del crecimiento celular anormal descontrolado que puede ser benigno o maligno. Los tumores benignos generalmente permanecen localizados. Los tumores malignos se denominan colectivamente cánceres. El término "maligna" generalmente significa que el tumor puede invadir y destruir

las estructuras del cuerpo vecinas y propagarse a sitios distantes para causar la muerte (para revisión, ver Robbins y AngelJ, 1976, Basic Pathology, 2da Edición, W.B. Saunders Ca.,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende una región Fc de IgGI variante, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en relación con una región Fc de IgGI silvestre, de manera que:

(1) dicha región Fc variante de dicho polipéptido se une a:

(A) FcyRlIlA con una mayor afinidad, y

(B) FcyRIIB con una afinidad de unión equivalente o alterada; en donde dichas afinidades de unión mayores, equivalentes o alteradas son en relación con las afinidades de unión exhibidas por dicho polipéptido a dicha FcyR que comprende una región Fc silvestre; y

(11) en donde dicha al menos una modificación de aminoácidos comprende una sustitución en la posición

243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina, y en la posición 396 con leucina; en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el índice de la UE como en Kabat.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dícho polipéptido es un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo, que contiene dicha región Fc variante.

3. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano.

4. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

5. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo comprende un dominio variable que se une a CD16A o CD32B.

6. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es el anticuerpo 286 producido por el hibridoma con la designación de depósito de patentes PTA-4591.

7. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es una versión humanizada 35 del anticuerpo 2B6 producido por el hibridoma con la designación de depósito de patentes PTA-4591.

8. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo inhibe competitivamente la unión de del anticuerpo 2B6 producido por el hibridoma con la designación de depósito de patentes PTA-4591 a CD32B.

9. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación

1.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. El vector de la reivindicación 10 el cual es un vector de expresión.

12. Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Un método para producir recombinantemente el polipéptido de la reivindicación 1, dicho método que comprende: (i) cultivar en un medio una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y (ii) recuperar dicho polipéptido de dicho medio.

14. El anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento además se une especificamente a un antígeno de cáncer o un antígeno de un agente infeccioso.

15. El anticuerpo, o fragmento de este de la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo terapéutico media la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos mejorada en relación con un anticuerpo terapéutico comparable que comprende una región Fc silvestre.

16. El anticuerpo, o fragmento de este, de la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo terapéutico es trastuzumab, rituximab, IGI4, edrecolomab, IMG-225, la versión humanizada del anticuerpo monoclonal LM609, Gampath 1 H/LOP-03, epratuzumab, o ibritumomab tiuxetan.

17. El anticuerpo, o fragmento de este, de la reivindicación 14, en donde dicho antígeno de cáncer is MAGE-I, MAGE-3, BAGE, GAGE-I, GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa, pIS, beta-catenina, MUM-1, GOK4, HER-2/neu, virus del papiloma humano-E6, virus del papiloma humano-E?, o MUG-l.

18. El uso del anticuerpo, o fragmento de este de la reivindicación 14 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por dicho antígeno de cáncer.

19. El uso de la reivindicación 18, en donde dicho antígeno de cáncer es MAGE-l , MAGE-3, BAGE, GAGE-I , GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa, pIS, beta-catenina, MUM-I , GDK4, HER-21neu, virus del papiloma humano-E6, virus del papiloma humano-E7, o MUG-I.

20. El uso de la reivindicación 18, en donde dicho antígeno de cáncer es un antígeno de carcinoma de mama, ovario, próstata, cervical, o pancreático.

. El uso de la reivindicación 18, en donde dicho medicamento comprende además una composición quimioterapéulica, radioterapéutica, hormonal terapéutica, o inmunoterapéutica.

22. El uso de la reivindicación 18, en donde dicho paciente es humano.

23. Una composición que comprende una cantidad terapéutica mente eficaz del pOlipéptido de la reivindicación 1, Y 25 un portador farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 2, y un portador farmacéuticamente aceptable.

25. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de este de la reivindicación 3. y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 14 o 15, y un portador farmacéuticamente aceptable.

27. La composición de la reivindicación 26, que comprende además uno o más agentes adicionales contra el cáncer.

28. Las composiciones de la reivindicación 27, en donde dicho uno o más agentes contra el cáncer es un agente quimioterapéutico, una radiación agente terapéutico, un agente terapéutico hormonal, o un agente inmunoterapéulico.

29. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de la reivindicación 2.

30. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 29.

31. El vector de la reivindicación 30 el cual es un vector de expresión.

32. Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 29.

33. Un método para producir recombinantemente el anticuerpo de la reivindicación 2, dicho método que comprende:

(i) cultivar en un medio una célula huésped que comprende

(a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo; y

(b) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo, bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho anticuerpo; y

(ii) recuperar dicho anticuerpo de dicho medio.

34. El Uso del polipéptido de la reivindicación t en un medicamento para el tratamiento o manejo de cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno de cáncer, en donde dicho pOlipéptido se une a 5 dicho antígeno de cáncer.

35. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo tiene una actividad ADCC mejorada en relaciÓn con la actividad ADCC de dicho anticuerpo si comprendiera una región Fc silvestre.

36. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha región Fc variante comprende además una o más de las modificaciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 5, 6, 7, u 8.