Haptenos, conjugados de haptenos, composiciones de los mismos y método para su preparación y uso.

Un conjugado que tiene una fórmula (hapteno)m-(conector)n-(grupo reactivo)0-(vehículo)p donde:

el hapteno es un mono- o dinitro pirazol; y,

m, n, o y p son 1.

Haptenos, conjugados de haptenos, composiciones de los mismos y método para su preparación y uso Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a haptenos, conjugados de haptenos y composiciones de los mismos utilizados con fines terapéuticos y de diagnóstico. Más concretamente, esta divulgación se refiere a haptenos, conjugados de haptenos y conjugados de anticuerpos anti-haptenos, que se pueden utilizar en diversas combinaciones para la identificación, visualización y/o cuantificación simultáneas de una pluralidad de dianas en una muestra, tales como múltiples dianas de ácido nucleico y protema en una muestra de tejido.

Antecedentes

Por lo general, solamente las moléculas de gran tamaño, los agentes infecciosos y los objetos extraños insolubles pueden provocar una respuesta inmune en un animal. Sin embargo, en determinados casos se puede provocar que los haptenos, que son moléculas pequeñas, provoquen una respuesta inmune, si primero se unen a un vehículo de gran tamaño (como una proteína) para formar un inmunógeno. Los haptenos, en combinación con anticuerpos anti- haptenos que se activan contra los inmunógenos y se aislan, son útiles para detectar dianas moleculares concretas. Por ejemplo, se pueden etiquetar fracciones de unión específica, como anticuerpos primarios y sondas de ácido nucleico, con una o más moléculas de hapteno, y una vez que estas fracciones de unión especifica están unidas a sus dianas moleculares se pueden detectar utilizando un conjugado de anticuerpo anti-apteno que incluye una etiqueta detectable como una enzima o una etiqueta fluorescente. La unión del conjugado de anticuerpo anti- hapteno detectable en una muestra indica la presencia de la diana en la misma.

La digoxigenina, presente exclusivamente en plantas Digitalis como un metabolito secundario, es un ejemplo de hapteno que se ha utilizado en diversos ensayos moleculares. La Patente estadounidense n° 4.469.797, titulada "Dlgoxlgenln Immunogens, Antibodies, Label Conjugates and Related Derivatives," divulga el uso de inmunoensayos para determinar las concentraciones de dlgoxlna en muestras de sangre, basándose en la unión especifica de los anticuerpos anti-digoxina al fármaco en la muestra de ensayo. La Patente estadounidense n° 5.198.537, titulada "Digoxigenin Derivatives and Use Thereof," describe una serie de derivados de digoxigenina adicionales que han sido utilizados en ensayos ¡nmunológlcos, tales como inmunoensayos.

Otros haptenos se han desarrollado para procedimientos analíticos, entre los que se incluyen la biotina y la fluoresceína. No obstante, cada uno de estos haptenos presenta inconvenientes específicos que han convertido a la dioxigenina en el hapteno preferido para los inmunoensayos sensibles. En el caso de la biotina, determinadas muestras biológicas incluyen biotina endógena, lo que puede provocar una interferencia de fondo. De igual modo, la fluoresceína, una molécula fluorescente, puede provocar fluorescencia de fondo en un inmunoensayo fluorescente. Para los ensayos in situ, como los ensayos inmunohistoquímicos (IHC) y los ensayos de hibridación in situ (ISH) de muestras de tejido y citológicas, especialmente los ensayos multiplexados de estas muestras, resulta sumamente recomendable Identificar y desarrollar nuevos haptenos y anticuerpos anti-haptenos (y conjugados de los mismos) para proporcionar una mayor flexibilidad al ensayo, especialmente dado que ahora resulta evidente que las muestras se pueden caracterizar mejor mediante la detección simultánea de múltiples dianas.

Un objetivo fundamental de la terapia del cáncer consiste en destruir de forma selectiva las células malignas, o inhibir su crecimiento incontrolado, aunque sin afectar negativamente a las células normales. Los fármacos quimioterapéuticos tradicionales son altamente citotóxicos y, a pesar de que preferiblemente tienen una mayor afinidad por las células malignas que por las células normales, por lo general tienen un efecto negativo sobre estas últimas. En la actualidad se están desarrollando nuevos agentes terapéuticos dirigidos a las vías de los nutrientes y del factor de crecimiento que regulan el crecimiento celular y el metabolismo en respuesta a estímulos intracelulares y ambientales. Estas vías de señalización a menudo se encuentran alteradas o desreguladas en el cáncer. Por ejemplo, determinados factores de crecimiento (como el EGF, un factor de crecimiento que desencadena la actividad de la proteína-receptor de tirosina quinasa (RTK) para iniciar una cascada de transducción de señales que provoca cambios en el crecimiento, la proliferación y diferenciación celular) participan en la patogénesis y progresión de diferentes cánceres. Estas vías y moléculas de señalización asociadas representan dianas atractivas para la intervención terapéutica, aunque cada vez resulta más evidente que las diferentes poblaciones de pacientes presentan tumores que parecen estar desregulados de diferentes maneras. Por ejemplo, una diana terapéutica concreta (o una combinación de dianas terapéuticas) puede estar presente solamente en los tumores de determinadas poblaciones de pacientes y, por tanto, la identificación de estas poblaciones que presentan la diana (o una combinación de dianas) se puede utilizar para clasificar a los pacientes como potenciales respondedores o potenciales no respondedores a un agente terapéutico (o a una combinación de terapéuticos) dirigido contra la diana (o dianas). El uso de diagnósticos complementarios para clasificar a los pacientes de esta manera es un primer paso para personalizar el tratamiento del cáncer en los pacientes individuales. Una mayor individualización de los tratamientos implicará indudablemente ensayos multiplexados para múltiples dianas terapéuticas.

Fong K-L et al., "Clinical pharmacology of 2,3-di-hydro-IH-im¡dazo-1,2-B-pyrazole by radio immunoassay", Cáncer treatment reports, Vol. 64, N° 12, 1980, pp. 1253-1260, divulga un radioinmunoensayo para IMPY.

JP 11 240879 A divulga un hapteno útil para preparar anticuerpos monoclonales.

US 4.469.797 A divulga conjugados inmunogénicos que comprenden (N sust¡tuido-am¡no)-3-desox¡d¡goxigenina unidos a materiales portadores inmunogénicos.

WO 95/03296A1 divulga sustancias intermedias de hapteno unidas y conjugados relacionados a base de carbazol y/o dibenzofurano.

WO 2005/001889 A2 divulga un quantum dot semiconductor aleado que comprende una aleación de al menos dos semiconductores.

US 6.100.099 A divulga reacciones en cadena de la ligasa multiplexadas.

W02005/064018 A2 divulga un método para preparar una sonda de ácido nucleico formando una citosina activada a través de una reacción catalizada por bisulfito.

WO 93/20094 Al divulga haptenos y conjugados relacionados basados en quinolina.

Lamentablemente, en los últimos años se han realizado muy pocas investigaciones dirigidas al desarrollo de otras clases de haptenos contra las que se puedan activar anticuerpos sensibles y específicos, para poder realizar ensayos altamente multiplexados. Estos ensayos altamente multiplexados serían útiles para controlar la respuesta de los individuos a un determinado régimen terapéutico y para las aplicaciones de diagnóstico relacionadas. La identificación de clases adicionales de haptenos y métodos para su uso en aplicaciones analíticas y terapéuticas representaría un importante avance de la técnica en este campo.

Resumen

Por tanto, debido a lo anteriormente expuesto, la técnica precisa de haptenos y conjugados de haptenos adicionales, que sean útiles para el diagnóstico y/o aplicaciones terapéuticas. Por consiguiente, determinadas realizaciones divulgadas de la presente invención se refieren a nuevas clases de haptenos y conjugados de haptenos.

La presente invención se define en las reivindicaciones

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado que tiene una fórmula (hapteno)m-(conector)n-(grupo reactivo)o-(vehículo)p donde: el hapteno es un mono- o dinitro pirazol; y, m, n, o y p son 1.

Preferiblemente, donde:

el conector, para acoplar un hapteno a un grupo reactivo, es homobifuncional o heterobifuncional y se selecciona del grupo compuesto por un grupo alifático, seleccionado del grupo compuesto por cadenas de hidrocarburo alifático que tienen uno o más sitios de insaturación o cadenas de alquilo, que incluyen opcionalmente grupos funcionales terminales y tienen una longitud de cadena de entre 1 y 30 átomos de carbono; un grupo óxido de alquileno, seleccionado del grupo compuesto por glicoles, opcionalmente glicoles de etileno de la fórmula (-OChhChhO-jn donde n tiene un valor de entre 2 y 15; o un conector disponible en el mercado... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado que tiene una fórmula (hapteno)m-(conector)n-(grupo reactivo)o-(vehículo)p donde:

el hapteno es un mono- o dinitro pirazol; y,

m, n, o y p son 1.

2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, donde:

el conector, para acoplar un hapteno a un grupo reactivo, es homobifuncional o heterobifuncional y se selecciona del grupo compuesto por un grupo alifático, seleccionado del grupo compuesto por cadenas de hidrocarburo alifático que tienen uno o más sitios de insaturación o cadenas de alquilo, que incluyen opcionalmente grupos funcionales terminales y tienen una longitud de cadena de entre 1 y 30 átomos de carbono; un grupo óxido de alquileno, seleccionado del grupo compuesto por glicoles, opcionalmente glicoles de etileno de la fórmula (-OChhChkO-jn donde n tiene un valor de entre 2 y 15; o un conector disponible en el mercado seleccionado del grupo compuesto por sulfosucc¡n¡m¡d¡l-4-(N-male¡m¡dometil)c¡clohexano-1-carbox¡lato(sulfo-SMCC), SMCC, EGS (etileno glicol bisjsuccinimidilsuccinato]), Sulfo-EGS (ethyleno glicol bisjsulfosuccinimidilsuccinato]), DTSSP (3,3- ditiobisjsulfosuccinimidilpropionatoj), DSS (disuccinimidil suberato), BS (bisjsulfosuccinimidil] suberato), DSG (disuccinimidil glutarato), y MSA (metil N-succinimidil adipato), o conectores sulfhidrilo reactivos seleccionados del grupo compuesto por DPDPB (1,4-di-[3'-(2'-piridilditio) propionamidojbutano), BM[PEO]3(1,11-bis- maleimidotrietilenglicol), BMH (bis-maleimidohexano), BM[PEO]2(1,8-bismaleimidodietilenglicol); HBVS (1,6-hexano- bis-vinilsulfona); DTME (ditiobis-maleimidoetano), BMDB (1,4-bis-maleimidil-2,3-dihidroxibutano), BMB (1,4-bis- maleimidiobutano) y BMOE (bis-maleimidoetano); o compuestos fotorreactivos seleccionados del grupo compuesto por BASED (bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro) y APG (p-azidofenil glioxal monohidrato;

el grupo reactivo, para acoplar un conector a un vehículo, se selecciona del grupo compuesto por un grupo amina reactivo seleccionado del grupo compuesto por un isotiocianato, un isocianato, una acil azida, un áster de NHS, un cloruro de ácido, un aldehido, un glioxal, un epóxido, un oxirano, un carbonato, un agente arilante, un imidoéster, una carbodiimida, un anhídrido y combinaciones de los mismos; un grupo functional tiol reactivo seleccionado del grupo compuesto por un haloacetilo, un haluro de alquilo, una maleimida, una aziridina, un derivado de acriloilo, un agente arilante; un reactivo de intercambio de tiol-disulfuro seleccionado del grupo compuesto por un disulfuro de piridilo, un TNB-tiol, un reducíante de disulfuro y combinaciones de los mismos; grupos funcionales carboxilato reactivos seleccionados del grupo compuesto por un diazoalcano, un compuesto de diazoacetilo, un compuesto de carbonildiimidazol, y una carbodiimida; grupos funcionales hidroxilo reactivos seleccionados del grupo compuesto por un epóxido, un oxirano, un carbonildiimidazol, un N,N'-disuccinimidil carbonato, un N- hidroxisuccinimidil cloroformato, un compuesto oxidante de periodato, un halógeno de alquilo y un isocianato; grupos funcionales aldehido y cetona reactivos seleccionados del grupo compuesto por una hidrazina, una base de Schiff, un producto de aminación reductivo, un producto de condensación de Mannich, y combinaciones de los mismos; un compuesto activo hidrógeno reactivo seleccionado del grupo compuesto por un derivado de diazonio, un producto de condensación de Mannich, un producto de reacción de yodinación, y combinaciones de los mismos; un grupo funcional químico fotorreactivo seleccionado del grupo compuesto por una arilo azida, una aril azida halogenada, una benzofonona, un compuesto diazo, un derivado de diazirina y combinaciones de los mismos; el vehículo se selecciona del grupo compuesto por un ácido amino, un polipéptido, una proteína, un nucleótido, una cadena de nucleótido, un ácido nucleico, AND, ARN, ARNm, un polímero, aminoalquil agarosa, cristal de aminopropilo y dextrano reticulado.

3. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el hapteno presenta la estructura siguiente

donde al menos uno de R1-R4 es un grupo nitro, opcionalmente dos de R1-R4 son grupos nitro y el resto de R1-R4 se utilizan para acoplar el hapteno a un conector o un vehículo.

4. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el hapteno tiene la

estructura siguiente

°N N

I

H

5. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una fórmula

O

o2n

IM

R

H

donde X tiene un valor de entre 2 y 24, y R es un grupo reactivo acoplado a un vehículo.

6. El conjugado de la reivindicación 5, donde el grupo reactivo es -COOH, y áster de NHS, o una hidrazida

7. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el conector es un polímero

que comprende entre 1 y 15 unidades de glicol de etileno.

8. El conjugado de la reivindicación 7, donde el conector es un glicol de polietileno que tiene 4, 8 o 12 unidades de glicol de etileno.

9. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el vehículo es una fracción de unión específica.

10. El conjugado de la reivindicación 9, donde el vehículo es un ácido nucleico.

11. El conjugado de la reivindicación 9, donde el vehículo es un anticuerpo.