Gen y proteína del adenovirus 36 E4 orf 1 y sus usos.

Un ácido nucleico aislado que consiste en la SEQ ID nº 10 una que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la SEQ ID nº 1 según la degeneración del código genético.

El desarrollo de esta invención fue financiado parcialmente por el gobierno en virtud de un subsidio de los Institutos Nacionales de la Salud (Nationallnstitutes o/ Health) de Estados Unidos de América, subsidio nº R-01 DK066164. El gobierno posee determinados derechos sobre esta invención.

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a una composición y una composición para su uso en el aumento de sensibilidad a la insulina y la mejoría de los síntomas de la diabetes o para ayudar en la lipodistrofia usando la proteína del adenovirus tipo 36 E4 orf 1 o el gen que codifica esta proteína.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Infectoobesidad

Debido a que la epidemia de la obesidad continúa sin detenerse, la infectoobesidad, la obesidad de origen infeccioso, ha recibido una mayor atención en los últimos años (1-3) . Aunque hay muchos factores que contribuyen a la etiología de la obesidad, un subconjunto de la obesidad podría estar causada por infecciones. En las últimas dos décadas, se han descrito 10 patógenos que promueven la obesidad (4) . Se describió cómo el primer virus humano, el adenovirus tipo 36 (Ad36) , causa la obesidad en animales infectados experimentalmente (s-7) y se demostró su asociación con la obesidad humana (8) .

Aunque se reconoce que la obesidad es una enfermedad con múltiples etiologías, sólo recientemente la infección microbiana como un factor etiológico ha recibido atención. Se han descrito siete virus y un agente de la tembladera o scrapie que ocasionan obesidad en-modelos animales (s-7, 10-20) . No se ha determinado aún cuál de estos patógenos puede causar una obesidad en humanos. Se ha descrito cómo el adenovirus aviar SMAM-1 y el adenovirus humano tipo 36 (Ad-36) ocasionan adiposidad en modelos animales (s-7, 15 Y 16) Y muestran asociación con la obesidad humana (8 y 17) . En experimentos in vitro se ha demostrado que la infección con Ad-36 de pre-adipocitos en ratas (3T3-Ll) y pre-adipocitos humanos promueven su proliferación y diferenciación (9) . Recientemente se han descrito los efectos de promoción de la obesidad de Ad-5, otro adenovirus humano (20) . Hasta la fecha, los adenovirus son el único tipo de virus relacionado con la obesidad humana. Por lo tanto, entre los patógenos adipogénicos constituyen los objetivos principales para la determinación de un papel en la obesidad humana.

Adenovirus [0006] Adenovirus: En humanos, las infecciones con adenovirus son comunes (21) y causan infecciones agudas de las vías respiratorias altas, enteritis o conjuntivitis. La presencia de anticuerpos contra los adenovirus es común en la población en general (22) . El ADN adenoviral se detecta en linfocitos asintomáticos de humanos adultos, y el número de células positivas aumenta con la edad de la persona (23 y 24) . Existen seis subgrupos principales (A-F) entre los 50 adenovirus humanos. Cada subgrupo posee un cierto número de serotipos específicos. El adenovirus tipo 36 (Ad-36) pertenece al subgrupo D, serotipo 36. El Ad-36 es serológicamente diferente al compararse con 48 tipos de adenovirus humanos con excepción de una reacción cruzada débil con Ad-29 (25 Y 26) . Los adenovirus son virus de ADN no rodeado (27) que se replican en el núcleo de la célula hospedadora. En todos los serotipos, los genes que codifican las funciones específicas están ubicados en la misma posición en el cromosoma viral (28) . El genoma comprende una molécula de ADN de doble hélice y linear sencilla, que comprende cinco unidades de transcripción tempranas (E1A, E1B, E2, E3 Y E4) , dos unidades de transcripción temprana retrasada (IX y IVa2) y una unidad tardía principal que genera cinco familias de mARNs (L1 a L5) . Los serotipos de adenovirus muestran diversidad genética que se promueve mediante eventos de recombinación que ocurren comúnmente entre los adenovirus.

Ciclo de replicación: La mayoría de los estudios sobre la replicación se han realizado usando Ad-2 o Ad-5, ya que pueden cultivarse fácilmente en el laboratorio, ya sea infectando células HeLa o KB. Convencionalmente, el ciclo de replicación se divide en dos fases. Los eventos tempranos incluyen la adsorción, penetración, transcripción y traducción de un conjunto temprano de genes. Los productos del gen viral temprano actúan como mediadores en la expresión genética viral, replicación del ADN, inducen la progresión del ciclo celular y bloquean la apoptosis. Una vez que se inicia la replicación del ADN viral, empieza la fase "tardía" con la expresión de los genes tardíos y el ensamblaje de los viriones de la progenie.

Adsorción y entrado: El enlace de los adenoviruses a las células está mediado por la proteína fibrosa. El dominio distal del carboxilo terminal de la proteína fibrosa termina en un botón que se piensa se enlaza al receptor celular (28) . Se ha demostrado que la proteína del receptor eoxsackievirus-adenovirus (receptor eAR) funciona como una proteína de acoplamiento celular para los serotipos del adenovirus de los subgrupos A, e, D, E Y F. Posteriormente, en un proceso que se ha demostrado es independiente de la interacción fibra-eAR, la proteína viral de la base pentona se enlaza a las integrinas celulares U v a través de un grupo tripéptido de la base pentona, seguida por la internalización de la partícula del virus. Sin embargo, los virus del grupo D podrían entrar a través de una ruta independiente de CAR, posiblemente por interacción directa de la base pentona e integrinas U v•

Activación de los genes virales tempronos: Existen tres funciones principales para la expresión del gen adenoviral temprano: (1) inducir a la célula hospedadora a entrar en la fase "Sil del ciclo celular para ofrecer condiciones óptimas para la replicación viral; (2) establecer sistemas virales que protejan la célula infectada de las defensas antivirales del organismo hospedador; y (3) sintetizar productos del gen viral para la replicación del ADN viral (28) . A continuación se describe brevemente el papel de las diferentes proteínas adenovirales.

Proteínas E1A: Una vez que el cromosoma viral llega al núcleo, ElA es la primera unidad de transcripción que se expresa. La transcripción ElA está controlada por un promotor constitutivo que también contiene un elemento estimulante duplicado. La unidad ElA codifica dos mARNs durante la fase temprana de infección y posteriormente 3 otras especies cuya función no se entiende completamente. Los dos mARNs tempranos codifican las proteínas 12S y 13S ElA, cuyo nombre se deriva del coeficiente de sedimentación de sus mARNs. Las proteínas E1A se conocen como transactivadores ya que pueden activar otros genes virales en transo La proteína 13S ElA se enlaza directamente a la proteína de enlace TATA y activa la transcripción. EIA también puede activar la transcripción enlazándose directamente a varios factores celulares como pRB, p300, ATF2 Y TBP. Los genes adenovirales tempranos se mantienen activos durante el ciclo de replicación viral aunque la velocidad de transcripción declina. EIA puede inducir a las células muscularesesqueléticas terminal mente diferenciadas a sintetizar ADN y dividirse. Esto también ocurre con los miocitos, adipocitos y miocardiocitos.

Proteínas E1B: La unidad de transcripción adenoviral EIB codifica dos proteínas diferentes, EIB 55-57 kDa y EIB 19-21 kDa, que bloquean la inhibición del crecimiento inducido por p53 y la apoptosis (28) . Las proteínas EIB antagonizan la detención del crecimiento y la apoptosis y cooperan con EIA para transformar oncogénicamente las células cultivadas. Su papel en la transformación oncogénica demuestra la capacidad de estas proteínas de interferir con los reguladores celulares normales.

Proteínas E2: La región E2 está subdividida en E2A y E2B Y codifica 3 proteínas. Estas proteínas proporcionan la maquinaria para la replicación del ADN viral. La proteína terminal (TP) actúa como un cebador para la iniciación de la síntesis de ADN. El gene DBP (proteína de enlace del ADN adenoviral) codifica la proteína de enlace del ADN y el gen poi codifica el ADN dependiente de la ADN polimerasa.

Proteínas E3: La unidad de transcripción del adenovirus E3 codifica siete proteínas, ninguna de las cuales se requiere para la replicación del virus en cultivo. Las proteínas de la unidad de transcripción E3 protegen a las células de la muerte mediada por las células citotóxicas T y las citoquinas inductoras de la muerte como el factor de necrosis tumoral (TNF) , ligando FAS y ligando inductor de la apoptosis relacionada con TNF. Los estudios sobre el subgénero adenovirus C han demostrado que la mayoría de las proteínas E3 exhiben funciones inmunomoduladoras. La glicoproteína E3/19K previene... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que consiste en la SEQ ID nº 10 una que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la SEQ ID nº 1 según la degeneración del código genético.

2. El ácido nucleico mencionado en la reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico es SEQ ID nº

1.

3. Un vector de transformación que comprende el ácido nucleico mencionado en la reivindicación 1, donde dicho vector se adapta para transponer las células adiposas mamíferas o células musculares esqueléticas mamíferas.

4. Un promotor que es funcional en las células animales, unido de forma operativa a un ácido 10 nucleico como el mencionado en la reivindicación 1.

5. Una célula animal transformada con el ácido nucleico mencionado en la reivindicación 4.

6. Una proteína aislada cuya secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID nº 2.

7. La proteína mencionada en la reivindicación 6, donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína es SEQ ID nº 2.

8. La proteína de las reivindicaciones 6 ó 7 para el uso en el tratamiento o mejora de los síntomas de una enfermedad en un paciente mamífero donde la enfermedad se selecciona de entre las del grupo que comprende lipodistrofia, diabetes o una enfermedad debida a la resistencia a la insulina y dicho uso comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéutica mente efectiva de la proteína donde los síntomas del paciente mejoran después de dicha administración.

9. La proteína para su uso como se indica en la reivindicación 8, donde la enfermedad está relacionada con la resistencia a la insulina y donde la sensibilidad del paciente a la insulina aumenta después de dicha administración.

10. La proteína para su uso como se indica en la reivindicación 8, donde la enfermedad es lipodistrofia y donde el número de células del tejido adiposo en el paciente aumenta después de dicha administración.

11. La proteína para su uso como se indica en la reivindicación 8, donde la diabetes es diabetes

S debida a una alta concentración de glucosa en el suero y donde la cantidad de glucosa en el suero disminuye después de dicha administración.

12. La proteína para su uso como se indica en la reivindicación 8, donde se administra la proteína adenovirus-36 E4 orf 1 introduciendo al mamífero un ácido nucleico que codifica la proteína del adenovirus-36 E4 orf 1, de manera que se permita la expresión de la proteína del

adenovirus-36 E4 orf 1.

13. La proteína para su uso como se indica en la reivindicación 12, donde se introduce el ácido nucleico mediante un método seleccionado de entre los del siguiente grupo que consiste en electroporación, transfección usando DEAE-dextrano, transfección usando fosfato de calcio, fusión de liposomas catiónicos, fusión de proptoplastos, creación de un campo eléctrico in vivo, bombardeo con microproyectiles recubiertos con ADN, inyección con virus recombinantes defectuosos en la replicación, recombinación homóloga, terapia genética in vivo, terapia genética ex vivo, vectores virales y transferencia de ADN desnudo.

14. El vector de la reivindicación 3 para el empleo en mejorar o inducir adipogénesis en un paciente mamífero; dicho empleo comprende la administración al tejido adiposo del paciente del vector donde la expresión de la secuencia codificada del aminoácido en el tejido adiposo del paciente causa la adipogénesis.

15. El vector de la reivindicación 3 para el empleo en mejorar o inducir la captación de glucosa en un paciente mamífero; dicho empleo comprende la administración al tejido muscular esquelético del paciente del vector donde la expresión de la secuencia codificada del

aminoácido en el tejido muscular esquelético del paciente causa el aumento en la captación

de glucosa.

16. El vector de la reivindicación 3 para el empleo en mejorar o inducir la sensibilidad a la insulina

en un paciente mamífero; dicho empleo comprende la administración al tejido adiposo del

5 paciente del vector donde la expresión de la secuencia codificada del aminoácido en el tejido

adiposo del paciente causa el aumento en la sensibilidad a la insulina.

17. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 3, 14, 15 ó 16, donde el ácido nucleico

comprende la SEQ ID nº 1.

10

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