Gen de nodulina precoz sensible a nitrógeno.

Una planta transgénica, una semilla de planta transgénica o una célula vegetal transgénica que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína OsENOD93 funcional,

en el que el ácido nucleico recombinante comprende:

a) una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

b) un ácido nucleico que hibrida específicamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación rigurosas;

c) una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

d) un ácido nucleico que hibrida específicamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones de hibridación rigurosas o

e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteínas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

Gen de nodulina precoz sensible a nitrogeno

REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS [0001] Se reivindica prioridad para la solicitud provisional de patente de EE. UU. N.D 61/099.954, presentada el 25 de septiembre de 2008, que se incorpora a este documento en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION [0002] La presente invencion se refiere en general a procedimientos para modular las caracteristicas de las plantas como el uso eficiente del nitrogeno (UEN) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION [0003] En los proximos 50 aros se ejercera una considerable presion sobre la produccion de cosechas a nivel mundial debido a una combinacion de factores como el aumento de la poblacion humana, un aumento en la utilizacion de las cosechas por persona y diversos problemas medioambientales. Teniendo en cuenta las tendencias actuales, sera necesario duplicar aproximadamente los rendimientos a nivel mundial durante este periodo de tiempo y supondra un esfuerzo considerable cumplir este desafio de forma economica y medioambientalmente sostenible (Rothstein SJ Plant Cell 2007, 19: 2695-2699) . El nitrogeno es un elemento fundamental para el crecimiento de las plantas y se considera que es el principal factor de control de la productividad vegetal despues de la deficiencia en agua (Lea PJ, Morot-Gaudr y J-F Plant nitrogen, 2001, Springer, Berlin, Londres) . La produccion de cosechas de alto rendimiento se asocia con la aplicacion de grandes cantidades de fertilizantes nitrogenados. Estas grandes entradas de nitrogeno se estiman actualmente en 90 millones de toneladas metricas y se han convertido en el principal coste a nivel mundial en la produccion de las cosechas (Frink CR, y col., PNAS 1999, 96: 1175-1180) . Sin embargo, el nitrogeno incorporado a las cosechas agricolas en raras ocasiones excede del 40% del nitrogeno aplicado, lo que indica una grave ineficacia en la utilizacion del nitrogeno (Raun WR, Johnson GV Agronomy Journal 1999, 91: 357

363; Glass ADM Critical Reviews in Plant Sciences 2003, 22: 453-470) . Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar cosechas con un mejor uso eficiente del nitrogeno (UEN) . [0004] Existen dos fases principales del uso del nitrogeno en el ciclo vital de las plantas. La primera es la fase vegetativa, en la que esta mas involucrada la asimilacion del nitrogeno. La segunda es la fase reproductiva, en la que estan involucrados tanto la asimilacion como la movilizacion del nitrogeno. Para medir el UEN se han desarrollado a lo largo de los aros varias definiciones y procedimientos de evaluacion, siendo uno de estos el rendimiento de biomasa o de grano frente a la cantidad de nitrogeno suministrado (Good AG, y col., Trends Plant Sci 2004, 9: 597-605) . En general, este UEN puede dividirse adicionalmente en dos partes, siendo una la eficacia de asimilacion y la otra la eficiencia de la utilizacion.

Para evaluar la base molecular de las respuestas de las plantas al nitrogeno e identificar los genes sensibles al nitrogeno, en varios estudios de respuesta al nitrogeno se ha empleado la obtencion de perfiles de expresion genica mediante micromatrices en Arabidopsis (Wang R., y col., Plant Cell 2000, 12: 1491-1509; Wang RC, y col., Plant Physiology 2003, 132: 556-567; Price J, y col., Plant Cell 2004, 16: 2128-2150; Scheible WR, y col.,

Plant Physiology 2004, 136: 2483-2499) . En otros estudios se han investigado los genes sensibles al nitrogeno de Arabidopsis bajo estres cronico de nitrogeno, asi como el cambio transcripcional transitorio tras un aumento corto y prolongado de la disponibilidad de nitrogeno (Bi YM, y col., BMC Genomics 2007, 8: 281) . Tambien se ha usado un sistema de crecimiento en suelo nitrogenado definido para Arabidopsis (Bi YM, y col., Plant Journal 2005, 44: 680692) para aislar el gen NLA, el cual controla la capacidad de adaptacion de Arabidopsis a la limitacion de nitrogeno,

e identificar genes adicionales implicados en la respuesta al nitrogeno (Peng M, y col., Plant J 2007, 50: 320-337; Peng MS, y col., Plant Molecular Biology 2007, 65: 775-797) . Tambien se han realizado estudios sobre genes sensibles al nitrogeno en raices de tomate (Wang YH, y col., Plant Physiol 2001, 127: 345-359) y en plantulas de arroz (Lian X, y col., Plant Mol Biol 2006, 60: 617-631) .

Aunque se han identificado muchos genes sensibles al nitrogeno a partir de los estudios anteriores, faltan publicaciones sobre como utilizar estos conocimientos para manipular la expresion genica de modo que esto permita que las plantas utilicen el nitrogeno de forma mas eficiente. Para cumplir esta necesidad, en la presente descripcion se proporciona un gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno (LOC Os06g05010) , denominado OsENOD93 y plantas que sobreexpresan este gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno, que muestran un aumento del UEN, incluyendo un aumento del rendimiento de semillas, tolerancia al estres, niveles de nitrato y niveles de aminoacidos. Tambien se proporcionan los procedimientos para producir dichas plantas, o alternativamente, procedimientos para mimetizar el fenotipo de sobreexpresion usando un activador del gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno. Tambien se proporcionan ademas acidos nucleicos y proteinas aislados utiles en los procedimientos descritos.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invencion es como se describe en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripcion proporciona acidos nucleicos y proteinas OsENOD93 aislados, vectores y celulas que expresan los acidos nucleicos descritos y anticuerpos que se unen especificamente a la proteina descrita. Entre los acidos nucleicos OsENOD93 representativos de la invencion se incluyen acidos nucleicos que comprenden a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1; b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas de hibridacion; c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID

NO: 2; d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas de hibridacion; e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3. Adicionalmente, entre los acidos nucleicos OsENOD93 representativos de la descripcion se incluyen acidos nucleicos que comprenden a) una secuencia de nucleotidos que es al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleotidos que es al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 2 y c) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 3. Entre las proteinas OsENOD93 representativas de la descripcion se incluyen proteinas que comprenden a) una secuencia de aminoacidos al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 3 y b) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3.

Tambien se proporcionan plantas que sobreexpresan OsENOD93, incluyendo plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, y los procedimientos para producir dichas plantas usando las secuencias de nucleotidos del gen OsENOD93 descrito en este documento. Las plantas OsENOD93 se caracterizan por un aumento de la expresion de OsENOD93 y un aumento del uso eficiente del nitrogeno.

Adicionalmente se proporcionan procedimientos para identificar agentes y activadores que se unen a OsENOD93. En un aspecto de la invencion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la proteina OsENOD93 con uno o mas agentes de ensayo o con un agente de control en condiciones suficientes para la union; c) analizar la union de un agente de ensayo a la proteina OsENOD93 aislada y d) seleccionar un agente de ensayo que muestre una union especifica a la proteina OsENOD93. En un aspecto adicional de la descripcion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una celula que exprese una proteina OsENOD93, b) poner en contacto la celula con uno o mas agentes de ensayo o un agente control; c) analizar la expresion del gen OsENOD93 y d) seleccionar un agente de ensayo que induce la elevacion de la expresion del gen cuando se pone en contacto con el agente de ensayo cuando se compara con el agente control. En otro aspecto de la descripcion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una planta que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la planta con uno o mas agentes de ensayo o un agente control; c) analizar el contenido de nitrogeno, la captacion de nitrogeno, el crecimiento lateral de las raices, el contenido de aminoacidos, el rendimiento de semillas o la biomasa de la planta y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca un aumento del contenido de nitrato, aumento de la captacion de nitrato, aumento del crecimiento lateral de las raices, rendimiento de semillas y/o aumento de la biomasa cuando... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgenica, una semilla de planta transgenica o una celula vegetal transgenica que comprenden un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional, en el que el acido 5 nucleico recombinante comprende:

a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones 10 de hibridacion rigurosas;

c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones 15 de hibridacion rigurosas o e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

2. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 1, en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es una monocotiledonea.

3. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 2,

en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es maiz. 25

4. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 2, en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es arroz.

5. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 1, 30 en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es una dicotiledonea.

6. Un procedimiento para producir una celula vegetal transgenica, que comprende: introducir un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional en una celula vegetal para

producir una celula de una planta transgenica, en el que el acido nucleico recombinante comprende:

a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridacion rigurosas;

c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones 45 de hibridacion rigurosas o e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

7. Un procedimiento para producir una planta transgenica, que comprende:

producir una celula vegetal transgenica segun el procedimiento de la reivindicacion 6, y regenerar la planta transgenica a partir de la celula vegetal transgenica.

8. Un procedimiento para aumentar o mejorar el uso eficiente del nitrogeno, los niveles de nitrato, el crecimiento lateral de las raices, el rendimiento de semillas, la tolerancia al estres, los niveles de aminoacidos y/o biomasas en una planta transgenica, una semilla de planta transgenica o una celula vegetal transgenica, que comprende:

expresar en la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional, en el que el acido nucleico recombinante comprende:

a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridacion rigurosas;

c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones de hibridacion rigurosas o e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de 15 aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el acido nucleico recombinante se expresa de forma constitutiva en la planta transgenica, semilla de la planta transgenica o celula de la planta transgenica.

10. El procedimiento de la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula de la planta transgenica muestra un aumento del rendimiento de semillas, de los niveles de aminoacidos o/y de la biomasa.

11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica muestra un aumento del uso eficiente del nitrogeno.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es una monocotiledonea. 30

13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es maiz.

14. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la planta transgenica, la semilla de planta 35 transgenica o la celula vegetal transgenica es arroz.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es una dicotiledonea.