Evaluación del uso de receptor/correceptor viral.

Un método para identificar mutaciones en proteínas de envoltura viral de un virus que alteran la neutralización mediada por anticuerpos que comprende:

(a) obtener muestras biológicas individuales de un sujeto en una pluralidad de momentos temporales diferentes durante la infección, comprendiendo cada muestra dicho virus; (b) clonar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprendiendo cada una un gen que codifica para una proteína de envoltura para una de las partículas de virus en la muestra del paso (a); (c) transfectar en una primera célula; (i) un ácido nucleico que comprende uno de los genes de envoltura clonados de (b); y (ii) un vector de expresión viral que carece del gen de envoltura viral, de tal manera que se produce una población de partículas virales individuales que expresa cada una una proteína de envoltura diferente de un sujeto; (d) poner en contacto una parte de cada una de las partículas de virus individuales que expresan una proteína de envoltura diferente producida con un anticuerpo contra el virus; (e) para cada población de partículas virales individuales, poner en contacto las partículas virales que han sido expuestas al anticuerpo y las partículas virales que no han sido expuestas al anticuerpo con una segunda célula, donde la segunda célula expresa un receptor o receptores de la superficie celular a los que se une el virus; (f) medir una cantidad de señal detectable producida por dichas segundas células para determinar la infecciosidad de las partículas virales que han sido y no han sido expuestas al anticuerpo, siendo producida dicha señal a partir de un ácido nucleico indicador; donde una infecciosidad reducida y, por tanto, una señal reducida producida por las partículas de virus expuestas al anticuerpo indica que las partículas de virus son susceptibles de neutralización por el anticuerpo; y (g) determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos algunas de las partículas de virus del paso (f) para determinar si una mutación o mutaciones en el gen que codifica la proteína de envoltura se correlaciona con la alteración de la neutralización mediada por anticuerpo del virus.

Evaluación del uso de receptor/correceptor viral

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La entrada de virus es una nueva diana atractiva para el tratamiento antiviral, y aproximadamente 10 fármacos que están diseñados para bloquear la unión del virus o fusión de la membrana están siendo evaluados actualmente en estudios clínicos o preclínicos (Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stehenson, 1999) . Los virus animales con envoltura se unen y entran en la célula huésped a través de la interacción de proteínas virales en la membrana del virión (proteínas de envoltura) y proteínas de la superficie celular (receptores de virus) . El

reconocimiento y enlace de receptores es mediado por la proteína de envoltura de superficie.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, es un objeto de la presente divulgación proporcionar un ensayo fenotípico sensible y

rápido para medir la susceptibilidad de un virus a inhibidores de la entrada viral.

Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un sistema de vector retroviral que produzca partículas de virus que contengan proteínas de envoltura viral derivadas de una variedad de fuentes y la identificación de líneas celulares que expresen receptores virales y toleren la replicación viral.

Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un vector de expresión para la envoltura viral que sea capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican genes de la envoltura.

Otro objeto de esta divulgación es proporcionar un vector bioseguro que represente la mayoría del

genoma viral del VIH-1 (HIV-1, en inglés) , pero porte un gen reportero de luciferasa en lugar de la región de envoltura.

Otro objeto de la presente divulgación es el ensayo fenotípico que reduce la probabilidad de formar VIH-1 infeccioso recombinante, proporcionando un vector de expresión viral que porte una deleción en una región reguladora transcripcional (la copia 3' de U3) del genoma del VIH-1.

Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el receptor/correceptor, que identifica de manera rápida y precisa los pacientes infectados con cepas de un virus trópico.

Estos y otros objetos pueden lograrse mediante un método para determinar si un virus tiene una susceptibilidad alterada a un compuesto, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una célula 30 huésped con el compuesto, donde la célula huésped comprende un ácido nucleico derivado de virus y un gen indicador, la actividad del gen indicador es afectada por la actividad del ácido nucleico derivado de virus de manera que un cambio en la actividad del ácido nucleico derivado de virus resulta en un cambio en la actividad del gen indicador, y el compuesto se dirige directa o indirectamente al ácido nucleico derivado de virus o una proteína que codifica, y (b) detectar la actividad del gen indicador, donde una diferencia en la actividad del gen indicador en la célula huésped en contacto con el compuesto en relación con la actividad en ausencia del compuesto, indica que el virus presenta una susceptibilidad alterada al compuesto.

En un aspecto, una primera célula comprende un ácido nucleico derivado de virus que codifica una proteína viral y un vector de expresión viral que carece del ácido nucleico que codifica la proteína viral y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de manera que la primera célula 40 produce una partícula viral que comprende la proteína viral codificada por el ácido nucleico derivado de virus. La primera célula puede ponerse en contacto con una segunda célula, por ejemplo, una célula huésped, en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partícula viral. En un modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para identificar si un compuesto inhibe la entrada de un virus en una célula que comprende: (a) obtener ácido nucleico que codifica 45 una proteína de envoltura viral de un paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera célula (i) el ácido nucleico del paso (a) , y (ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura, y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de manera que la primera célula produce partículas virales que comprenden la proteína de envoltura codificada por el ácido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partículas virales producidas en el paso (b) con 50 una segunda célula en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de señal producida por la segunda célula para determinar la infecciosidad de las partículas virales; y (e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad

de señal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la entrada del virus en la segunda célula.

En otro aspecto, una primera célula comprende un ácido nucleico derivado de virus que codifica una proteína viral y vector de expresión viral que carece del ácido nucleico que codifica la proteína viral, de manera 5 que la primera célula produce una partícula viral que comprende la proteína viral codificada por el ácido nucleico derivado de virus. La primera célula puede ponerse en contacto con una segunda célula, por ejemplo, una célula huésped, en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partícula viral. Además, la segunda célula comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable. En un modo de realización, el ácido nucleico indicador se integra en el ácido nucleico de la segunda célula.

En un modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) poner en contacto una célula huésped con una preparación de anticuerpos del paciente, donde la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica una proteína viral del paciente y un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable; (b) medir la cantidad de señal detectable producida por la célula huésped; y (c) comparar la cantidad de señal medida en el paso (b) con la cantidad de señal producida en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpo indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la proteína viral capaz de bloquear la infección.

En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) transfectar en una primera célula (i) un ácido nucleico que codifica una proteína viral del paciente, y (ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica la proteína viral, y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de tal manera que la primera célula produce partículas virales que comprenden la proteína vital codificada por el ácido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto las partículas virales producidas en el paso (8) con una preparación de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto las partículas virales y la preparación de anticuerpos del paso (b) con una segunda célula, donde la segunda célula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de señal detectable producida por la segunda célula para determinar la infecciosidad

de las partículas virales; y (e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la proteína viral capaz de bloquear la infección.

En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) transfectar en una primera célula (i) un ácido nucleico que codifica una proteína viral del paciente, y (ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar mutaciones en proteínas de envoltura viral de un virus que alteran la neutralización mediada por anticuerpos que comprende:

(a) obtener muestras biológicas individuales de un sujeto en una pluralidad de momentos temporales diferentes durante la infección, comprendiendo cada muestra dicho virus;

(b) clonar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprendiendo cada una un gen que codifica para una proteína de envoltura para una de las partículas de virus en la muestra del paso (a) ;

(c) transfectar en una primera célula; (i) un ácido nucleico que comprende uno de los genes de

envoltura clonados de (b) ; y (ii) un vector de expresión viral que carece del gen de envoltura viral, de tal manera que se produce una población de partículas virales individuales que expresa cada una una proteína de envoltura diferente de un sujeto;

(d) poner en contacto una parte de cada una de las partículas de virus individuales que expresan una proteína de envoltura diferente producida con un anticuerpo contra el virus;

(e) para cada población de partículas virales individuales, poner en contacto las partículas virales que han sido expuestas al anticuerpo y las partículas virales que no han sido expuestas al anticuerpo con una segunda célula, donde la segunda célula expresa un receptor o receptores de la superficie celular a los que se une el virus;

(f) medir una cantidad de señal detectable producida por dichas segundas células para determinar la infecciosidad de las partículas virales que han sido y no han sido expuestas al anticuerpo, siendo producida dicha señal a partir de un ácido nucleico indicador; donde una infecciosidad reducida y, por tanto, una señal reducida producida por las partículas de virus expuestas al anticuerpo indica que las partículas de virus son susceptibles de neutralización por el anticuerpo; y

(g) determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos algunas de las partículas de virus del paso (f) para determinar si una mutación o mutaciones en el gen que codifica la proteína de envoltura se correlaciona con la alteración de la neutralización mediada por anticuerpo del virus.

2. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además el uso de mutagénesis dirigida para generar una población de partículas de virus mutantes específicas que tiene una de las mutaciones en el gen que codifica la proteína de envoltura del paso (g) y someter a ensayo las partículas de virus mutantes específicas para determinar su infecciosidad con la exposición al anticuerpo en comparación con la ausencia de exposición al anticuerpo.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el virus es un retrovirus, un lentivirus, un 35 hepadnavirus, un flavivirus o un herpesvirus.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el virus es el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) .

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las moléculas de 1 C (i) y 1 C (ii) pueden

bien ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, o bien pueden encontrarse en moléculas de ácido 40 nucleico separadas.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo es aislado a partir del mismo sujeto o de un sujeto diferente.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sujeto ha sido vacunado con una de

entre una vacuna terapéutica, una vacuna profiláctica, un candidato de vacuna terapéutica, o un candidato de 45 vacuna profiláctica; dirigida contra el virus.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sujeto es un ser humano.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sujeto es un animal.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el vector de expresión viral comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable.

13. El método de las reivindicaciones 1 a la 11, donde la segunda célula comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable tras la infección con el virus.

14. El método de las reivindicaciones 12 y 13, donde el ácido nucleico indicador comprende un gen que codifica luciferasa.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el receptor es al menos uno de entre CD4, CXCR4 o CCR5.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ácido nucleico que codifica la proteína

de envoltura codifica la glicoproteína de envoltura de superficie (gp120) y/o la glicoproteína de envoltura transmembrana (gp41) .

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el vector de expresión viral comprende un gen gag-pol de ácido nucleico de VIH.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la primera célula es una célula humana.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la segunda célula es una célula humana.

Dibujos ENSAYO DE ENTRADA DE VIH PHENOSENSE

VECTOR DE EXPRESIÓN DE ENVOLTURA: pHIVenvENVOLTURA DE VIH

VECTOR DE EXPRESIÓN DE VIH-1 : pHIVluc∆U3

LUCIFERASA GEN INDICADOR

PHENOSENSE™ HIV: ENSAYO CELULAR

ADN

ADN pHIVluc∆U3

pHIVenv TRANSFECCIÓN INFECCIÓN

INHIBIDORES DE ENTRADA DE VIRUS AÑADIDOS

ESTRATEGIAS DE EXPRESIÓN DE ENVOLTURA DE VIH

DETECCIÓN DE TROPISMO POR EL CORRECEPTOR

CÉLULAS QUE EXPRESAN CCR5

SIN FÃ?RMACO

INHIBIDOR

CCR5

INHIBIDOR

CXCR4

REPLICA 1

REPLICA 2

SIN FÃ?RMACO

INHIBIDOR

CCR5

INHIBIDOR

CXCR4

CÉLULAS QUE EXPRESAN CXCR4

INTERPRETACIÓN DE ENSAYO DE TROPISMO POR EL CORRECEPTOR

CÉLULAS R5 CÉLULAS X4

SIN FÃ?RMACO INHIBIDOR DE R5

INHIBIDOR DE X4 % INHIB. POR

INHIBIDOR DE R5 % INHIB. POR

INHIBIDOR DE X4

SIN FÃ?RMACO INHIBIDOR DE R5 INHIBIDOR DE X4

% INHIB. POR

INHIBIDOR DE R5 % INHIB. POR

INHIBIDOR DE X4

SIN FÃ?RMACO INHIBIDOR DE R5

INHIBIDOR DE X4% INHIB. POR

INHIBIDOR DE R5 % INHIB. POR

INHIBIDOR DE X4

DUAL O MIXTONO VIABLELÃ?MITE RLU ACTIVOLÃ?MITE RATIO TROPISMO

SIN FÃ?RMACO INHIBIDOR DE R5 INHIBIDOR DE X4

% INHIB. POR

INHIBIDOR DE R5 % INHIB. POR

INHIBIDOR DE X4

SUSCEPTIBILIDAD AL INHIBIDOR DE ENTRADA: INHIBIDOR DE FUSIÓN

CONCENTRACIÓN DE FÃ?RMACO

% INHIBICIÓN

SUSCEPTIBILIDAD REDUCIDA: INHIBIDOR

DE FUSIÓN

CONCENTRACIÓN DE FÃ?RMACO

% INHIBICIÓN

SUSCEPTIBILIDAD AL INHIBIDOR DE ENTRADA: INHIBIDOR DE CCR5

FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE R5CÉLULA: CD4/CCR5

% INHIBICIÓN

SUSCEPTIBILIDAD AL INHIBIDOR DE ENTRADA: INHIBIDOR DE CXCR4

FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE X4 CÉLULA: CD4/CXCR4

% INHIBICIÓN

AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIA DE ENVOLTURA

NP: plasma negativo VIH

Nº de aislados Tropismo por el correceptor

Indefinido Nº de aislados VARIANTE A VARIANTE B VARIANTE C VARIANTE D VARIANTE E

Subtipo de envoltura

EXPRESIÓN DE CORRECEPTOR Y RECEPTOR DE CÉLULA DIANA

CÉLULAS CCR5 + CXCR4

CÉLULAS CCR5

CÉLULAS CXCR4

INHIBICIÓN POR ANTAGONISTAS DE CORRECEPTOR

FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE X4FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE X4FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE X4CORRECEPTOR: X4, R5

CORRECEPTOR: R5CORRECEPTOR: X4

% INHIBICIÓN

% INHIBICIÓN

% INHIBICIÓN

% INHIBICIÓN

% INHIBICIÓN % INHIBICIÓN HOJA ALTERNATIVA (NORMA 26)

FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE R5 FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE R5 FÃ?RMACO: INHIBIDOR DE R5 CORRECEPTOR: X4, R5

CORRECEPTOR: R5

CORRECEPTOR: X4

PÉPTIDOS INHIBIDORES DE FUSIÓN

ENTRACELULAR

INTRACELULAR

PÉPTIDOS

VIRUS DE PACIENTE V. ANTICUERPOS DE PACIENTE

FECHA PLASMA (ANTICUERPO)

VIRUS DE REFERENCIA