Métodos de evaluación del tratamiento de un paciente con inhibidores de la entrada viral por medio de ensayos de virus recombinantes.

Un método para guiar el tratamiento de un paciente, que consta en identificar lasensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto diseñado para inhibirla penetración de un virus en una célula al:

a) Suministrar una muestra de paciente comprendiendo ácido nucleico quecodifica proteínas de la envoltura viral

b) Transfectar dentro de una primera célula

(i) El ácido nucleico del paso a) y

(ii) Un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico quecodifica una proteína de la envoltura y que comprende un ácidonucleico indicador que produce una señal detectable,

De manera que la primera célula produce partículas virales comprendiendoproteínas de la envoltura codificadas por el ácido nucleico del paso a);

c) Poner en contacto las partículas virales producidas en el paso b) conuna segunda célula en presencia del compuesto, donde la segundacélula expresa un receptor de superficie celular al que el virus se une;

d) Medir la cantidad de señal producida por la segunda célula paradeterminar la infectividad de las partículas virales; y

e) Comparar la cantidad de señal medida en el paso d) con la cantidad deseñal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidadreducida de señal medida en presencia del compuesto indica lasensibilidad de los virus de un paciente al compuesto;

Donde, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden serutilizados en el tratamiento del paciente.

METODOS DE EVALUACION DEL TRATAMIENTO DE UN PACIENTE CON INHIBIDORES DE LA ENTRADA VIRAL POR MEDIO DE ENSAYOS DE VIRUS RECOMBINANTES Descripcion [0001] A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones por autor 5 y fecha dentro del texto. Las citaciones completas de dichas publicaciones estan enumeradas en orden alfabetico al final de la especificación que precede a las reivindicaciones. CAMPO DE LA INVENCION [0002] La entrada viral es un nuevo objetivo atractivo para el tratamiento antiviral.

Alrededor de 10 farmacos disenados para bloquear la adhesión del virus o la fusión de la membrana estan siendo evaluados en la actualidad en estudios pre-clinicos o clinicos (Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stephenson, 1999) . Los virus animales envueltos se adhieren a la celula huesped y penetran en ella por medio de la interacción de proteinas virales en la membrana del virión (proteinas de la envoltura) y

proteinas de la superficie celular (receptores de virus) . El reconocimiento y la unión de los receptores son intercedidos por la proteina de envoltura de la superficie.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION [0003] Esta revelación alude a un ensayo fenotipico rapido y sensible que mide la sensibilidad de un virus a los inhibidores de la entrada viral.

Esta revelación alude a un sistema de vectores retrovirales que produce particulas virales que contienen proteinas de la envoltura viral derivadas de una variedad de fuentes y a la identificación de lineas celulares que expresan receptores virales y son permisivas para la replicación viral. [0005] Esta revelación alude a un vector de expresión para la envoltura viral que es capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican los genes de la envoltura. [0006] Esta revelación alude a un vector bioseguro que representa la mayor parte del genoma viral del VIH-1, pero que transporta un gen reportero luciferasa en lugar de la región de la envoltura.

Esta revelación alude a un ensayo fenotipico que reduce la probabilidad de formar VIH-1 infeccioso recombinante al proporcionar un vector de expresión viral que transporta una deleción en una región transcripcional reguladora (la copia 3' de U3) del genoma del VIH-1. [0008] Esta revelación alude a un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el receptor/correceptor, que identifica rapidamente y con precisión a los pacientes infectados por cepas del virus tr6pico.

La presente invención proporciona un metodo para guiar el tratamiento de un paciente que comprende la identificación de la sensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto disenado para inhibir la penetración de un virus en una celula al:

a) Suministrar una muestra del paciente compuesta por acido nucleico 5 que codifica las proteinas de la envoltura viral b) Transfectar dentro de una primera celula i. El acido nucleico del paso a) y

ii. Un vector de expresión viral que carece de un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, tal que la primera celula produce particulas virales que constan de las proteinas de la envoltura codificadas por el acido nucleico del paso a) ; c) Poner en contacto las particulas virales producidas en el paso b) con una segunda celula en presencia del compuesto, en el cual la segunda 15 celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus se une; d) Medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y e) Comparar la cantidad de senal medida en el paso d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, en el cual una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica la sensibilidad de los virus de un paciente al compuesto;

en el cual, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden ser utilizados en el tratamiento del paciente. 25 BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1A. Estructura de los vectores de expresión viral y vectores de expresión de la envoltura El vector de expresión de la envoltura del VIH-1 (pHIUVenv) es modificado para aceptar las secuencias de la envoltura que han sido amplificadas desde muestras de plasma de paciente. Las designaciones a/b y c/d se refieren a sitios de endonucleasa de restricción que se encuentran en los extremos ' y 3' de la poliproteina de la envoltura del VIH-1 (gp1º0) . El vector de expresión del VIH (pHIVIucAU3) codifica todas las proteinas del VIH a excepción de la poliproteina de la envoltura. Una parte del gen de la envoltura se ha eliminado para alojar un cassette genico indicador. La "luciferasa de luciernaga" que se utiliza para controlar la habilidad de un virus de reproducirse en presencia o ausencia de farmacos antivirales. La región 3' U3 se ha eliminado parcialmente para prevenir la transcripción desde la repetición terminal larga (LTR) ' en celulas infectadas. El virus producido en este sistema es limitado a una (nica ronda de replicación.

Figura 1B. Ensayo de entrada basado en la celula Las pruebas de sensibilidad farmacológica, tropismo por el correceptor y neutralización viral se realizan mediante la cotransfección de pHIVenv y pHIVIucAU3 en la celula huesped. La celula huesped produce particulas de VIH pseudotipadas con secuencias de la envoltura del VIH derivadas del virus de prueba o de la muestra de paciente. Las particulas virales se recogen (-48h) despues de la transfección y se utilizan para infectar celulas diana que expresan los receptores (ej. CD4) y los correceptores (ej. CXCR4, CCRº) del VIH. Despues de la infección (-ººh) , las celulas diana se lisan y la actividad de luciferasa se mide. El VIH tiene que completar una ronda de replicación para infectar la celula huesped diana con exito y producir actividad de luciferasa. Si el virus es incapaz de penetrar en la celula diana, la actividad de luciferasa disminuye. Este sistema se puede utilizar para evaluar la sensibilidad a los inhibidores de entrada, el tropismo por el receptor y por el correceptor y la neutralización viral.

Figura 2. Vectores de expresión de la envoltura del VIH Las secuencias de la envoltura del VIH se amplifican desde muestras de paciente y se insertan dentro de vectores de expresión por medio de sitios de endonucleasa de restricción (º' a/b y 3' c/d) . La transcripción de la envoltura es conducida por el gen temprano promotor del citomegalovirus (CMV) humano. El

ARN de la envoltura es poliadenilado mediante una secuencia de senal (A+) de la poliadenilación del virus del simio 40 (SV40) . Un intrón que se encuentra entre el promotor del CMV y las secuencias de la envoltura del VIH esta disenado para incrementar los niveles de ARNm de la envoltura en celulas transfectadas. FL-expresa proteinas de la envoltura de longitud completa (gp1º0, gp41) . ACT-expresa proteinas de la envoltura (gp1º0, gp41) que carecen del dominio de la cola citoplasmatica del C-terminal de gp41. +CTexpresa proteinas de la envoltura (gp1º0, gp41) que contienen un dominio constante y predefinido de la cola citoplasmatica de gp41. gp1º0-expresa proteinas gp1º0 derivadas del paciente junto con una gp41 constante predefinida. gp41- expresa una constante predefinida gp1º0 junto con las proteinas gp41 derivadas del paciente.

Figura 3A. Ensayo de evaluación del tropismo por el correceptor En esta figura, los ensayos se realizan mediante dos lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCRº (los seis cuadros de arriba) . La otra linea celular expresa CD4 y CXCR4 (los seis cuadros de abajo) . El ensayo se realiza mediante la infección de celulas con un gran n (mero de reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con los vectores pHIVenv y pHIVlucAU3. El ejemplo que se muestra representa el analisis de 9º virus en formato de placas de 9 pocillos. Las infecciones se realizan en ausencia de farmacos (sin farmacos) o en presencia de un farmaco que inhibe preferiblemente o a los virus tr6picos Rº (inhibidor de CCRº) o a los virus tr6picos X4 (inhibidor de CXCR4) . El tropismo por el correceptor se eval (a mediante la comparación de la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo de celula, tanto en presencia como en ausencia de farmaco (ver Figura 3B para la interpretación de los resultados del ensayo) .

Figura 3B. Determinación del tropismo el correceptor En esta figura, los resultados del ensayo se interpretan mediante la comparación de la habilidad de cada virus de muestra de infectar (producir actividad de luciferasa) en celulas que expresan CD4/CCRº (celulas Rº) o celulas que expresan CD4/CXCR4 (celulas X4) . Tambien se eval (a la habilidad de un inhibidor de CCRº o CXCR4 de bloquear selectivamente la infección (inhibir actividad de luciferasa)... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para guiar el tratamiento de un paciente, que consta en identificar la sensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto disenado para inhibir la penetración de un virus en una celula al:

a) Suministrar una muestra de paciente comprendiendo acido nucleico que codifica proteinas de la envoltura viral b) Transfectar dentro de una primera celula

(i) El acido nucleico del paso a) y

(ii) Un vector de expresión viral que carece de un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable,

De manera que la primera celula produce particulas virales comprendiendo proteinas de la envoltura codificadas por el acido nucleico del paso a) ;

c) Poner en contacto las particulas virales producidas en el paso b) con una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de superficie celular al que el virus se une;

d) Medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y

e) Comparar la cantidad de senal medida en el paso d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica la sensibilidad de los virus de un paciente al compuesto;

Donde, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden ser utilizados en el tratamiento del paciente.

2. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el acido nucleico indicador comprende un gen indicador.

3. El metodo de la reivindicación º, en el cual el gen indicador es un gen de luciferasa.

4. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el receptor de superficie celular es CD4.

5. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el receptor de superficie celular es un receptor de quimiocina.

6. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el receptor de superficie celular es CXCR4 o CCRº.

7. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el paciente es infectado con el virus VIH

1.

8. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el acido nucleico del paso a) comprende ADN que codifica gp1º0 y gp41.

9. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el vector de expresión viral comprende acido nucleico del VIH.

10. El metodo de la reivindicación 9, en el cual el vector de expresión viral comprende un gen gag-pol del VIH.

11. El metodo de la reivindicación 9, en el cual el vector de expresión viral comprende ADN que codifica vif, vpr, tat, rev, vpu y nef.

12. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la primera celula es una celula de mamifero.

13. El metodo de la reivindicación 1º, en el cual la celula de mamifero es una celula humana.

14. El metodo de la reivindicación 13, en el cual la celula humana es una celula de riñón embrionaria humana.

15. El metodo de la reivindicación 14, en el cual la celula de riñón embrionaria humana es una celula º93.

16. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la segunda celula es un linfocito T humano.

17. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la segunda celula es una linea celular de leucemia de linfocitos T humanos.

18. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la segunda celula es una celula mononuclear de sangre periferica.

19. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la segunda celula es una celula de astroglioma.

20. El metodo de la reivindicación 19, en el cual la celula de astroglioma es una celula U8º.

21. El metodo de la reivindicación 1, en el cual la segunda celula es una celula de osteosarcoma humano.

22. El metodo de la reivindicación º1, en el cual la celula de osteosarcoma humano es una celula HT4.

23. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el compuesto se une al receptor de superficie celular.

24. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el compuesto es un ligando del receptor de superficie celular.

25. El metodo de la reivindicación º3, en el cual el compuesto comprende un anticuerpo.

26. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el compuesto inhibe la fusión de la membrana.

27. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el compuesto es un peptido, un peptido-mimetico, una molecula organica o un compuesto sintetico.

28. El metodo de la reivindicación 1, en el cual el compuesto se une a la proteina de envoltura viral.

29. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el metodo se utiliza para guiar el tratamiento de pacientes en los que el tratamiento con farmacos antirretrovirales ha fallado.

Vector de expresión de la envoltura:

Envoltura del VIH

Vectores de expresión de la envoltura del VIH

FIGURA 2

Inhibición º