Ensayos de potencia de unión de una sustancia medicamentosa de anticuerpo a un receptor FC.

Un método para determinar la potencia de un producto medicamentoso que comprende un péptido de unión a un FcR,

donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión Fc y el método es un método ex vivo que comprende:

i) determinar la unión de un péptido de unión a FcR de referencia estándar a un receptor Fc;

ii) determinar la unión de un péptido de unión a FcR del producto medicamentoso a dicho receptor Fc; y

iii) comparar la unión a FcR en la etapa ii) con la unión a FcR de la etapa i) y utilizar la información obtenida por la comparación para estimar la potencia de la sustancia medicamentosa.

donde

a) la unión con el receptor Fc de la etapa ii) se determina de la misma manera que la unión con el receptor Fc de la etapa i),

b) al menos un mecanismo de acción del péptido de unión a FcR del producto medicamentoso está mediado por medio de la unión del péptido de unión a FcR a un receptor Fc, y

c) donde el péptido de unión a FcR de referencia estándar y el péptido de unión a FcR del producto

medicamentoso son dos preparaciones diferentes del mismo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión Fc.

Ensayos de potencia de unión de una sustancia medicamentosa de anticuerpo a un receptor FC

Campo de la invención La invención se refiere a un método de caracterización de un anticuerpo, cuyo método es adecuado como ensayo de potencia para el lanzamiento por lotes de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, específicamente para su uso cuando se solicita una autorización de comercialización de dicha composición farmacéutica.

Antecedente de la invención Cuando se produce una composición farmacéutica, no es suficiente formular la sustancia medicamentosa en un producto medicamentoso, también es vital que el producto medicamentoso resultante se apruebe por el organismo regulador del país en el que se va a utilizar la composición farmacéutica. En los Estados Unidos, el organismo regulador adecuado es la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) (http://www.fda.gov/) , y en Europa, es por ejemplo la Agencia Europea de Evaluación de Productos Medicinales (EMEA) (http://www.emea.er.int/) .

El proceso de aprobación está intensamente regulado y los desarrolladores de fármacos necesitarán remitir una cantidad sustancial de información con respecto al producto medicamentoso a las autoridades reguladoras con el fin de obtener la aprobación. Esto puede incluir información con respecto a la potencia del producto medicamentoso y los ensayos para determinar esta potencia.

Tales ensayos de potencia sirven para caracterizar el producto, para controlar que sea constante lote a lote y para asegurar la estabilidad del producto, y por lo tanto debería ser lo suficientemente sensible para detectar diferencias que puedan impactar en el mecanismo de acción y función del producto y por lo tanto tengan una importancia clínica potencial. Además, es deseable que el ensayo de potencia tenga una relación lo más estrecha posible con la supuesta actividad fisiológica/farmacológica del producto.

Un ensayo de potencia adecuado debería cumplir los siguientes criterios primarios:

- capacidad para medir el valor de la potencia con las especificaciones del producto. -alta sensibilidad para la detección de diferencias de importancia clínica potencia.

-estrecha relación con el mecanismo de acción y la supuesta actividad fisiológica/farmacológica del producto.

Un ensayo de potencia seleccionado según los criterios primarios debería también cumplir los siguientes criterios secundarios:

-variación intra e inter-ensayo lo suficientemente baja (para obtener la precisión necesaria para apoyar las

especificaciones del producto) . -robustez suficiente -que sea rectificable para análisis de alto rendimiento.

El desarrollo de las técnicas para producir anticuerpos monoclonales recombinantes ha dado lugar a una cantidad significativa de investigación en el uso terapéutico de anticuerpos monoclonales dirigidos contra dianas de enfermedad. Posteriormente se han aprobado para su comercialización varias composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos monoclonales o están en desarrollo clínico por todo el mundo. La utilidad terapéutica de un anticuerpo como fármaco depende de la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno, pero a menudo las actividades del anticuerpo mediadas por Fc también tienen un papel crítico en el mecanismo de acción. Además, aunque el efecto de algunos productos medicamentosos de anticuerpo se consigue simplemente por la unión del anticuerpo al antígeno que da como resultado por ejemplo en el bloqueo del acceso de los ligandos al antígeno, la actuación de ciertos productos medicamentosos de anticuerpo pueden depender además de funciones efectoras, tal como por ejemplo, la unión a receptores Fc y/o la inducción de la activación del complemento.

El Zanolimumab (también denominado HuMax-CD4) es un anticuerpo monoclonal completamente humano con una cadena pesada IgG1 y una cadena ligera de tipo Kappa (IgG1, k) que se dirige contra CD4 humano (documento EP0854917) . El Zanolimumab se fabrica en un cultivo celular de mamífero (CHO) y se purifica por cromatografía de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. La sustancia medicamentosa zanolimumab se formula a 20 mg/ml en una solución salina tamponada de fosfato, pH 7, 4 para dar lugar al producto medicamentoso zanolimumab Un mecanismo del zanolimumab es mermar y/o inactivar las células T CD4+. Esto puede producirse por ejemplo por medio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , modulación negativa de la expresión de CD4 en la superficie de las células T, y/o interferencia con la transducción de señal de CD4, activación de células T, y proliferación de células T. Todas estas categorías de mecanismos de acción dependen de la unión 65 del antígeno CD4 con el resto de unión del antígeno del zanolimumab localizado en el fragmento Fc. Además, la ADCC y la regulación negativa de CD4 necesitan la unión de la región Fc del zanolimumab a un rece3ptor Fc. Se ha

identificado la inducción de ADCC como un mecanismo importante de la acción del Zanolimumab.

El Zalutumumab (también denominado HuMax-EGFr) es un anticuerpo humano dirigido contra el EGFr humano con una cadena pesada del isotipo IgG1 y una cadena ligera de tipo kappa (IgG1, k) (documento WO02/100348) . El

Zalutumumab se fabrica actualmente en un cultivo celular en suspensión de mamífero (CHO) , que expresa Zalutumumab utilizando el sistema vector GS, y purificado por procedimientos de afinidad e intercambio iónico, que incluyen procedimientos de inactivación vírica específica y eliminación. El producto medicamentoso Zalutumumab (20 mg/ml) se formula diluyendo la sustancia medicamentosa Zalutumumab (25 mg/ml) en un tampón que contiene 50 mM de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, un 3% (p/v) de manitol, un 0, 02% (p/v) de polisorbato 80 y un 0, 01% (p/v) de EDTA y ajustado a un pH de 6, 0. También se observó un efecto antitumoral en ratones con una baja ocupación de los receptores por el HuMax-EGFr, lo cual se basa probablemente en el compromiso de mecanismos inmunitarios efectores, en particular la ADCC. Por tanto, un mecanismo de acción de HuMax-EGFr, la ADCC, es por medio de interacciones Fc-FcR.

La potencia de los anticuerpos con la que el Fc se une al receptor Fc tiene un papel crítico para el mecanismo de acción, se medía tradicionalmente por el uso de ensayos biológicos en los que el efecto estimado depende de la unión Fc-receptor Fc. Tales ensayos pueden incluir ADCC, inducción o inhibición de la activación de células T que necesitan entrecruzamiento de anticuerpos o la inducción o inhibición de producción de citoquinas tal como la producción de interleucina 2 (IL-2) . Sin embargo, tales ensayos son relativamente engorrosos, son altamente variables debido a variaciones esperadas debido al cultivo celular o debido a que a menudo se necesitan células primarias. En particular esto último presenta una variabilidad debido a las variaciones en el estado inmunitario del donante, los polimorfismos de los genes que se expresan y las variaciones en la pureza del tipo celular. Tales ensayos biológicos por lo tanto pueden ser menos óptimos para los fines de lanzamiento por lotes. Existe por lo tanto una necesidad de ensayos de potencia rápidos, eficaces y sensibles que muestren una relación estrecha con el mecanismo de acción y la supuesta actividad fisiológica/farmacológica del producto medicamentoso de anticuerpo para su uso en la producción de composiciones farmacéuticas que comprenden particularmente anticuerpos en los que el mecanismo de acción depende de la unión a receptores Fc.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método para determinar la potencia de un producto medicamentoso que comprende un péptido de unión a un FcR, donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión Fc y el método es un método ex vivo que comprende:

i) determinar la unión de un péptido de unión a FcR de referencia estándar a un receptor Fc; ii) determinar la unión de un péptido de unión a FcR del producto medicamentoso a dicho receptor Fc; y iii) comparar la unión a FcR en la etapa ii) con la unión a FcR de la etapa i) y utilizar la información obtenida por la comparación para estimar la potencia de la sustancia medicamentosa.

donde a) la unión con el receptor Fc de la etapa ii) se determina de la misma manera que la unión con el receptor Fc de la etapa i) , b) al menos un mecanismo de acción del péptido de unión a FcR del producto medicamentoso está mediado por

medio de la unión del péptido de unión a FcR a un receptor Fc, y c) donde el péptido de unión a FcR de referencia estándar... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la potencia de un producto medicamentoso que comprende un péptido de unión a un FcR, donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión 5 Fc y el método es un método ex vivo que comprende:

i) determinar la unión de un péptido de unión a FcR de referencia estándar a un receptor Fc; ii) determinar la unión de un péptido de unión a FcR del producto medicamentoso a dicho receptor Fc; y iii) comparar la unión a FcR en la etapa ii) con la unión a FcR de la etapa i) y utilizar la información obtenida por la comparación para estimar la potencia de la sustancia medicamentosa.

donde a) la unión con el receptor Fc de la etapa ii) se determina de la misma manera que la unión con el receptor Fc de la etapa i) , b) al menos un mecanismo de acción del péptido de unión a FcR del producto medicamentoso está mediado por medio de la unión del péptido de unión a FcR a un receptor Fc, y c) donde el péptido de unión a FcR de referencia estándar y el péptido de unión a FcR del producto medicamentoso son dos preparaciones diferentes del mismo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión Fc.

2. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión a FcR, donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que contiene un resto de unión Fc y el método es un método ex vivo que comprende:

a) la producción de un producto medicamentoso que comprende dicho péptido de unión a FcR; b) someter dicho producto medicamentoso a un método de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar la potencia de un producto medicamentoso que comprende un péptido de unión a FcR; y c) utilizar la información obtenida en la etapa b) como parte de una evaluación de si el producto medicamentoso se puede utilizar como una composición farmacéutica.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el método para determinar la potencia de un producto medicamentoso que comprende un péptido de unión a FcR se utiliza como un ensayo de potencia para el lanzamiento por lotes.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la unión del péptido de unión a FcR al receptor Fc se determina por el uso de un método que comprende

(i) poner en contacto una muestra del producto medicamentoso en contacto con un receptor Fc durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el péptido de unión a FcR se una al receptor Fc, y

(ii) detectar la cantidad de péptido de unión a FcR unido al receptor Fc.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde la detección se lleva a cabo por el uso de un anticuerpo de detección dirigido al péptido de unión a FcR. 45

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, donde el anticuerpo de detección es un anticuerpo marcado.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la unión del péptido de unión a FcR al receptor Fc se determina por el uso de un ELISA, un ensayo AlphaScreen™, un radioinmunoensayo, un ensayo Biacore, un FMAT o un DELFIA.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde un mecanismo de acción del péptido de unión a FcR es inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o está mediado por inducción de ADCC o regulación negativa de los receptores diana.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde un mecanismo de acción del péptido de unión a FcR:

(a) está mediado por el reclutamiento de células citolíticas naturales y/o la inducción de ADCC por células citolíticas naturales;

(b) está mediado por el reclutamiento de leucocitos polimorfonucleares, la inducción de ADCC por leucocitos polimorfonucleares, la inducción de desgranulación de PMN yo la inducción de fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares;

(c) está mediado por la inducción de ADCC por monocitos o macrófagos; 65 (d) es inducir la agregación plaquetaria y/o está mediado por el reclutamiento de plaquetas;

(e) es inducir la producción de citoquinas y/o está mediado por el reclutamiento de células citolíticas naturales y/o

células T;

(f) es inducir el aclaramiento de complejos inmunitarios y/o está mediado por el reclutamiento de monocitos o macrófagos;

(g) es inducir la regulación negativa de las respuestas de anticuerpo y/o está mediado por el reclutamiento de 5 células B;

(h) es inducir la inhibición de la función efectora de monocitos y macrófagos y/o está mediado por el reclutamiento de monocitos y/o macrófagos;

(i) es inducir la fagocitosis y/o está mediado por el reclutamiento de leucocitos polimorfonucleares, macrófagos y/o células dendríticas;

(j) está mediado por la inducción de fagocitosis por monocitos o macrófagos;

(k) es inducir el entrecruzamiento y/o está mediado por el entrecruzamiento de células y/o anticuerpos;

(l) es inducir señalización positiva por medio de un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor y/o está mediado por el reclutamiento de células mieloides, células T y/o plaquetas

(m) es inducir la señalización positiva por medio de cadenas comunes , β,  y/o está mediado por el 15 reclutamiento de células mieloides, leucocitos polimorfonucleares, células citolíticas naturales o células T; o

(n) es inducir la señalización negativa por medio de un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor y/o está mediado por el reclutamiento de células B, macrófagos y/o monocitos.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde al menos uno de los receptores Fc a los que se une in vivo el péptido de unión al FcR se expresa en las células citolíticas naturales, leucocitos polimorfonucleares, monocitos, macrófagos, plaquetas, células T, células B, células dendríticas o células mieloides.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el receptor Fc es un receptor

FcRIa, FcRII, FcRIIa, FcRIIb, FcRIIc, FcRIII, FcRIIIa, FcRIIIb, o FcRn o un fragmento de cualquiera de los 25 mismos cuyo fragmento mantiene la actividad de unirse a una región Fc.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el receptor FcRIII es un receptor FcRIIIa176V o un fragmento del mismo que mantiene la capacidad de unirse a una región Fc, por ejemplo, el dominio extracelular.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el receptor Fc para su uso en dicho método se ha preparado por un método de preparación que incluye una etapa, cuya etapa de como resultado el receptor Fc que tiene una cantidad reducida de ácido siálico en la glucosilación ligada a N en comparación con un receptor Fc similar preparado por un método de preparación que no incluye tal etapa.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el receptor Fc se ha expresado en una célula huésped defectuosa en los mecanismos responsables de la sialilación o que se trata con una sialidasa antes de su uso en dicho método.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo monoclonal.

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el péptido de unión a FcR es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el péptido de unión al FcR es un anticuerpo IgG1, tal como un anticuerpo IgG1,  o un anticuerpo IgG1, .

18. Un método como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde la determinación de la unión del anticuerpo a un receptor Fc se combina con un método que determina la unión del anticuerpo a su antígeno.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde la unión el anticuerpo a su antígeno se determina por un método que comprende

(i) poner en contacto una muestra del anticuerpo con el antígeno durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo se una al antígeno, y

(ii) detectar la cantidad de anticuerpo unido al antígeno.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, donde la detección se lleva a cabo con el uso de un anticuerpo de detección dirigido contra el anticuerpo del producto medicamentoso.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, donde el anticuerpo de detección es un anticuerpo marcado.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde la unión del anticuerpo a su 65 antígeno se determina por el uso de un ELISA, un ensayo AlphaScreen™ o un radioinmunoensayo.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, donde el mismo ELISA se utiliza también para determinar la unión del anticuerpo al receptor Fc, el ensayo AlphaScreen™ también se utiliza para determinar la unión del anticuerpo al receptor Fc o el radioinmunoensayo también se utiliza para determinar la unión el anticuerpo al receptor Fc.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, donde el radioinmunoensayo utiliza perlas conjugadas con el receptor Fc y un antígeno radioyodado.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde el péptido de unión a FcR es un

anticuerpo que se une al CD4 humano, EGFR humano, CD20 humano, TAC humano, CD3 humano, GPIIb/IIIa humano, CD25 humano, Her-2/neu humano, CD33 humano, CD52 humano o CTLA4 humano.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, donde: el anticuerpo contra el CD4 humano es zanolimumab, keliximab, clenoliximab, TNX 355, TRX-1, IOT4a o 4162W94; el anticuerpo que se une al EGFR humano es cetuximab o HuMax-EGFR; el anticuerpo que se une al CD20 humano es rituximab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab o HuMax-CD20; el anticuerpo que se une al TAC humano es HuMax-TAC; el anticuerpo que se une a CD3 humano es muromonab; el anticuerpo que se une al CD25 humano es daclizumab o basiliximab; el anticuerpo que se une a HER-2/neu humano es trastuzumab o pertuzumab; el anticuerpo que se une a CD52 humano es alemtuzumab; o el anticuerpo que se une a CTLA4 es MDX-010.

27. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde se utiliza un anticuerpo de captura his que reviste la placa ELISA para capturar el fragmento FcR o FcR marcado con his.