Ensayos de actividad de serotipo A de toxina botulínica de base inmunológica.

Método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de:

a. tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A en aproximadamente 500 pM o menos de una NTBo/A, y en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en la línea celular SiMa (n.º DSMZ ACC 164), la línea celular Neuro-2a (n.º de catálogo ATCC CCL-131TM), N18 (n.º ECACC 88112301), LA1-55n (n.º ECACC 06041203), PC12 (n.º de catálogo ATCC CCL-1721TM) y SH-SY5Y (n.º de catálogo ATCC CRL-2266TM);

b. aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

c. poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo α-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo α-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxiloterminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, el anticuerpo α- SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para la SNAP-25 intacta de menos de 1 x 101 M-1 s-1; y el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0,450 nM; d. detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo α-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.

Ensayos de actividad de serotipo A de toxina botulínica de base inmunológica La capacidad de toxinas clostridiales, tales como, por ejemplo, las neurotoxinas botulínicas (NTBo) , NTBo/A, NTBo/B, NTBo/C1, NTBo/D, NTBo/E, NTBo/F y NTBo/G, y la neurotoxina tetánica (NTTe) , para inhibir la transmisión neuronal está aprovechándose en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase por ejemplo, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004) . Las toxinas clostridiales disponibles comercialmente como composiciones farmacéuticas incluyen, preparaciones de NTBo/A, tales como, por ejemplo, BOTOX (Allergan, Inc., Irvine, CA) , DYSPORT/RELOXIN, (Ipsen Ltd., Slough, Inglaterra) , PURTOX (Mentor Corp., Santa Barbara, CA) , XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania) , NEURONOX (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) , BTX-A (Biogen-tech Ltd., University, Yantai, Shandong, China) ; y preparaciones de NTBo/B, tales como, por ejemplo, MYOBLOC/NEUROBLOC (Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, CA) . Como ejemplo, BOTOX está aprobado actualmente en los EE.UU. para el tratamiento de distonía cervical en adultos para disminuir la gravedad de la posición anómala de la cabeza y el dolor de cuello asociados con la distonía cervical; para el tratamiento de hiperhidrosis axilar primaria grave que se gestiona de manera inadecuada con agentes tópicos; y para el tratamiento de estrabismo y blefaroespasmo asociados con distonía, incluyendo blefaroespasmo esencial benigno o trastornos del nervio VII en pacientes de 12 años de edad y más.

A partir de Jones et al, J of Immun Methods 329 (2008) 92-101, se conoce un inmunoensayo de endopeptidasa SNAP-25. El ensayo usa un sustrato de péptido SNAP25137-206 sintético y se realiza el ensayo sobre una placa recubierta con sustrato. El ensayo detecta la actividad de cadena ligera de una toxina botulínica A.

En la actualidad, el bioensayo de DL50 de ratón, una prueba de letalidad, sigue siendo el método de referencia usado por todos los fabricantes farmacéuticos para expresar la potencia de sus preparaciones. S. S. Arnon et al., JAMA

285: 1059-1070 (2001) . De hecho, las unidades en las etiquetas de las preparaciones farmacéuticas son unidades de DL50 de ratón y el número de animales necesarios para producir datos de DL50 estadísticamente útiles es grande. La ventaja del bioensayo de DL50 de ratón es que mide todas las etapas necesarias para la captación de la toxina botulínica (por ejemplo, unión de la toxina a un receptor de superficie celular, internalización del complejo toxinareceptor, translocación de cadena ligera en el citoplasma, escisión de cadena ligera de sustrato) , en vez de determinar meramente la actividad sólo para parte de este proceso de intoxicación, tal como, por ejemplo, ensayos in vitro que sólo miden la actividad enzimática de cadena ligera. Desafortunadamente, el bioensayo de DL50 de ratón presenta muchos inconvenientes incluyendo alto coste operativo debido a los grandes números de animales de laboratorio requeridos, una falta de especificidad puesto que todos los serotipos de NTBo producirán el mismo punto final medible y el potencial de inexactitud a menos que se usan grandes grupos de animales. Además, los grupos en defensa de los derechos de los animales han ejercido presión sobre las agencias normativas en los EE.UU. (FDA/NICEATM/ICCVAM) y Europa (MHRA y EDQM) , y sobre las empresas farmacéuticas que fabrican productos de neurotoxina botulínica para reducir las pruebas con animales y de manera más importante reemplazar el bioensayo de DL50 de ratón para la liberación del producto. Las agencias normativas están involucrando a las empresas farmacéuticas para que aplique el principio de las “R” a las pruebas de potencia de neurotoxinas botulínicas: Reducir, Refinar, Reemplazar. D. Straughan, Progress in Applying the Three Rs to the Potency Testing of Botulinum Toxin Type A, Altern. Lab. Anim. 34 (3) : 305-313 (2006) . En los últimos años, se han adoptado varias medidas ya para reducir y refinar el bioensayo de DL50 de ratón con el fin de normalizar el protocolo y producir datos más sistemáticos usando menos animales por ensayo.

Por tanto, un ensayo de actividad de toxina botulínica sencillo, fiable, validado y aceptable por agencias gubernamentales que puede evaluar la integridad de todas las etapas necesarias en la captación de toxina botulínica sería de valor significativo debido a que un ensayo no basado en animales de ese tipo paliaría la necesidad de pruebas con animales y todas las desventajas, costes y problemas éticos asociados con este tipo de ensayo basado en animales. La presente memoria descriptiva proporciona composiciones, células y métodos novedosos para someter a ensayo la actividad de una toxina botulínica A útiles para diversas industrias, tales como, por ejemplo, las industrias farmacéutica y alimentaria, y proporciona también ventajas relacionadas. Tales composiciones, células y métodos no usan animales vivos ni tejidos tomados de animales vivos, pero puede evaluar todas las etapas necesarias para la acción de la neurotoxina.

Descripción detallada de los dibujos La figura 1 muestra un esquema del paradigma actual de liberación de neurotransmisores e intoxicación por toxinas clostridiales en una neurona central y periférica. La figura 1A muestra un esquema para el mecanismo de liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación puede describirse como que comprende dos etapas: 1) anclaje vesicular, en el que la proteína SNARE unida a vesículas de una vesícula que contiene moléculas de neurotransmisores se asocia con las proteínas SNARE unidas a la membrana ubicadas en la membrana plasmática; y 2) liberación de neurotransmisores, en la que la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas de neurotransmisores experimentan exocitosis. La figura 1B muestra un esquema del mecanismo de intoxicación para la actividad de toxina tetánica y botulínica en una neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación puede describirse como que comprende cuatro etapas: 1) unión al receptor, en la que la toxina clostridial se une a un complejo de receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, en la que tras la unión a la toxina, una vesícula que contiene un complejo de toxina/sistema de receptor experimenta endocitosis en la célula; 3) translocación de cadena ligera, en la que se cree que se producen múltiples acontecimientos, incluyendo cambios en el pH interno de una vesícula, formación de un poro de canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de toxina clostridial, separación de la cadena ligera de toxina clostridial de la cadena pesada, y liberación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera de toxina clostridial escinde de manera proteolítica sus sustratos de SNARE diana, tales como, por ejemplo, SNAP-25, VAMP o sintaxina, impidiendo de ese modo el anclaje vesicular y la liberación de neurotransmisores.

La figura 2 muestra una comparación de la captación de NTBo/A en cuatro líneas celulares mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La figura 2A muestra un gráfico de producto de corte de SNAP-25 detectado basándose en la cantidad de NTBo/A usada para tratar la línea celular. Se analizaron los datos en SigmaPlot usando un modelo logístico de 4 parámetros y se obtuvieron los valores de CE50 para cada línea celular. La clasificación de las señales de producto de corte de SNAP-25 detectadas fue: SiMa >> Neuro-2a>LA1-55n> PC12. La figura 2B muestra las relaciones señal-ruido de las señales sin procesar a 300 pM frente a 0 pM y se calcularon a 1, 2 pM frente a 0 pM para el ensayo. Las células SiMa generaron las mayores relaciones señal-ruido y los menores valores de CE50.

La figura 3 muestra la optimización de medios de diferenciación celular para líneas celulares establecidas útiles en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.

La figura 4 muestra la optimización del tiempo de diferenciación celular para células que comprenden una línea celular establecida útil en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.

La figura 5 muestra la optimización del tratamiento con NTBo/A de células que comprenden una línea celular establecida útil en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de:

a. tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A en aproximadamente 500 pM o menos de una NTBo/A, y en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en la línea celular SiMa (nº DSMZ ACC 164) , la línea celular Neuro-2a (nº de catálogo ATCC CCL-131TM) , N18 (nº ECACC 88112301) , LA1-55n (nº ECACC 06041203) , PC12 (nº de catálogo ATCC CCL-1721TM) y SH-SY5Y (nº de catálogo ATCC CRL-2266TM) ;

b. aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

c. poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo α-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida,

en el que el anticuerpo α-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxiloterminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para la SNAP-25 intacta de menos de 1 x 101 M-1 s-1; y el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0, 450 nM;

d. detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo α-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el producto de corte de SNAP-25 es SNAP-25197.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo se detecta usando un ELISA de tipo sándwich.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método tiene una relación señal-ruido en la asíntota inferior de al menos 3:1 y una relación señal-ruido en la asíntota superior de al menos 10:1.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra comprende como máximo 100 pM de una NTBo/A

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A en aproximadamente 100 pM o menos de una NTBo/A.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método se realiza en un modo monoplex o un modo múltiplex.

8. Método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de:

a. añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes α-NTBo/A;

b. tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; y en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en la línea celular SiMa (nº DSMZ ACC 164) , la línea celular Neuro-2a (nº de catálogo ATCC CCL-131TM) , N18 (nº ECACC 88112301) , LA1-55n (nº ECACC 06041203) , PC12 (nº de catálogo ATCC CCL-1721TM) y SH-SY5Y (nº de catálogo ATCC CRL-2266TM) ;

c. aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

d. poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo α-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo α-SNAP-25;

en el que el anticuerpo α-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxiloterminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para la SNAP-25 intacta de menos de 1 x 101 M-1 s-1; y el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0, 450 nM;

e. detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo α-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;

f. repetir las etapas b-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes α-NTBo/A; y

g. comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f,

en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes α-NTBo/A.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo monoclonal α-SNAP-25 comprende al menos una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 100, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 101 o una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 102.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo α-SNAP-25 comprende

a. una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80 o SEQ ID NO: 82; y

b. una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 92.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que

a. una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 100; y

b. una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 115.

FIG.2.

FIG.4.