Ensayo de acetaminofeno.

Un procedimiento para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra,

comprendiendo el procedimiento los pasos de:

hidrolizar el acetaminofeno para formar p-aminofenol;

conjugar de forma oxidativa el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol usando un segundo reactivo (R2) que comprende el cromóforo xilenol en presencia de un catalizador adecuado para formar un producto coloreado y determinar la cantidad del producto coloreado formado, siendo la cantidad del producto coloreado proporcional a la cantidad de acetaminofeno inicialmente presente en la muestra,

en el que el paso de hidrólisis del acetaminofeno a p-aminofenol comprende poner en contacto el acetaminofeno con un primer reactivo (R1) que comprende una aril acilamidasa, y

en el que el catalizador es MnCl2.anhidro o hidratado.

Ensayo de acetaminofeno

Campo de la invención

En general, la presente invención se refiere a un ensayo para determinar la concentración de paminofenol presente en una muestra. Más en particular, la presente invención se refiere a un ensayo enzimático para determinar la concentración de acetaminofeno presente en una muestra.

Antecedentes de la invención

La toxicidad farmacológica es una causa principal de insuficiencia hepática aguda. En la evaluación de la insuficiencia hepática, el laboratorio de análisis clínicos juega un papel vital en el diagnóstico de modo que pueda iniciar el tratamiento apropiado de manera oportuna.

El acetaminofeno (N-acetil-p-aminofenol) se ha prescrito desde hace tiempo como analgésico y antipirético. Se puede obtener fácilmente sin receta y es un componente activo de muchas formulaciones terapéuticas frecuentes, como remedios para el catarro y la gripe. El uso extendido de este fármaco lo coloca arriba en la lista de fármacos sospechosos hepatotóxicos en pacientes que presentan disfunción hepática.

Aunque que las dosis terapéuticas de acetaminofeno en raras ocasiones causan efectos adversos, se han notificado casos en los que el uso excesivo crónico de acetaminofeno producía hepatotoxicidad y nefrotoxicidad. La ingestión de cantidades sobredosis agudas de acetaminofeno producen una depleción de las reservas de glutatión y la acumulación de metabolitos tóxicos en el hígado, lo que puede causar insuficiencia hepática severa o incluso mortal.

Cuando se ingiere acetaminofeno en cantidades excesivas, se acumula en el hígado N-acetil-pbenzoquinoneimina, un compuesto intermedio altamente reactivo. Este compuesto intermedio reacciona con tioles en el hígado, en concreto, con el glutatión. El glutatión se oxida a disulfuro de glutatión (GSSG) . Los niveles excesivos de GSSG en el hígado causan necrosis. La toxicidad del acetaminofeno generalmente se muestra a concentraciones séricas por encima de aproximadamente 20 mg/dl (1324 μmoles/l) .

El precursor del glutatión, la N-acetilcisteína (NAC) , se administra a menudo como antídoto en casos de sobredosis de acetaminofeno. Aproximadamente el 70% de la NAC administrada se metaboliza en el hígado. Se considera que la NAC funciona como antídoto al menos por los siguientes motivos: es un precursor del glutatión, es un potente antioxidante y aumenta la eficacia de la GSSG reductasa en el hígado. Se considera que la administración de NAC minimiza o previene el daño causado por una sobredosis de acetaminofeno, al menos en parte, recargando las reservas de glutatión y evitando la acumulación de GSSG en el hígado.

A menudo se administra una alta concentración de NAC en una dosis de carga inicial seguida de niveles de mantenimiento de NAC durante el transcurso del tratamiento. La dosis de carga puede dar lugar a niveles séricos de NAC de 2000 mg/l o superiores, y los niveles de mantenimiento están a menudo entre aproximadamente 800 mg/l y 1000 mg/l. Es deseable controlar los niveles de acetaminofeno durante el transcurso del tratamiento con 45 NAC para asegurarse de que se mantiene un nivel terapéutico apropiado evitando una exposición innecesaria o excesiva a NAC.

La incidencia de sobredosis accidentales, así como intencionadas, de acetaminofeno ha aumentado significativamente. El diagnóstico y tratamiento de las sobredosis de acetaminofeno requieren una detección precoz

y una determinación precisa del fármaco en el organismo. La cantidad de acetaminofeno incorporada debe determinarse rápidamente y de forma precisa de modo que los médicos puedan administrar rápidamente una dosis terapéutica apropiada de NAC al paciente. Existe una alta demanda de análisis clínicos rápidos, fiables y sólidos para determinar la concentración de acetaminofeno en muestras biológicas.

Entre los procedimientos conocidos para determinar los niveles de acetaminofeno en muestras biológicas se incluyen, por ejemplo, diversas técnicas cromatográficas y espectrofotométricas.

Se ha comprobado que la cromatografía líquida de gases y la cromatografía líquida de alta resolución son procedimientos fiables y precisos para determinar los niveles de acetaminofeno en las muestras biológicas, no

obstante, ambos son procedimientos lentos que requiere equipos caros y un alto nivel de experiencia técnica para su realización. Estos procedimientos no se adaptan especialmente a los laboratorios de análisis de urgencia donde se necesitan resultados rápidos.

Se ha utilizado ampliamente la espectrometría diferencial aunque este procedimiento requiere largas extracción con el solvente, por lo que no es apropiado para análisis clínicos. Procedimientos espectrofotométricos más rápidos no ofrecen, en general, la especificidad deseada.

Entre las técnicas colorimétricas se incluyen la colorimetría simple así como ensayos colorimétricos con enzimas. También hay disponibles diversos ensayos enzimáticos, pero estos tienden a ser significativamente más caros y, por tanto, menos adecuados, especialmente en el ámbito clínico.

Aunque los ensayos enzimáticos son más adecuados y económicos en comparación con los ensayos inmunológicos, generalmente son menos fiables porque tienden a mostrar interferencia con moléculas biológicas a menudo presentes en las muestras de los pacientes, como la bilirrubina y la hemoglobina. Niveles elevados de estas moléculas en las muestras de los pacientes pueden dar lugar a resultados falsos positivos (véase, por ejemplo, Bertholf y col., 2003) , que potencialmente pueden llevar a diagnósticos erróneos y a la elección de un tratamiento o dosis inadecuados.

Los ensayos enzimáticos conocidos también están sometidos a interferencia en presencia de niveles terapéuticos de NAC. Por tanto, generalmente no pueden usarse ensayos enzimáticos para controlar los niveles de acetaminofeno durante el transcurso del tratamiento con NAC debido a la inexactitud de los niveles de acetaminofeno medidos. Esta es una desventaja significativa de los ensayos enzimáticos de acetaminofeno conocidos.

Los ensayos enzimáticos conocidos emplean tres componentes principales: una enzima aril acilamidasa, un compuesto cromogénico (o que forma color) y un agente oxidante con suficiente potencial oxidativo para catalizar la reacción de conjugación.

La aril acilamidasa escinde el enlace amido del acetaminofeno para producir p-aminofenol y acetato. A continuación, el p-aminofenol reacciona con el compuesto cromogénico en una reacción de conjugación oxidativa en presencia de un catalizador oxidante para formar un producto coloreado. Entre los catalizadores típicos se incluyen sales metálicas o complejos metálicos de especies que tienen oxígeno reactivo o grupos funcionales, como permanganato, per y odato, persulfato, sulfato o acetato. A continuación se utiliza el cambio de absorbancia, medido típicamente a la longitud de onda que captura la absorbancia del pico del producto colorado para determinar la concentración de acetaminofeno en la muestra. Esta puede determinarse comparando los valores de absorbancia obtenidos con un patrón o conjunto de patrones de concentración de acetaminofeno conocida y probados por el mismo procedimiento. La cantidad de moles de producto coloreado formado típicamente es proporcional a la cantidad de moles de acetaminofeno inicialmente presente en la muestra.

Los primeros ensayos enzimáticos de acetaminofeno requerían tiempos de incubación muy largos, a menos de más de 1 hora, para cada una de las reacciones de hidrólisis y de conjugación oxidativa, lo que hacía que fueran inadecuados para su uso en un ámbito de urgencia clínica.

Hammond y col. (1984) desarrollaron un ensayo enzimático rápido para determinar la concentración de acetaminofeno en suero usando una aril acilamidasa para hidrolizar el acetaminofeno a p-aminophenol. El paminofenol se hace reaccionar posteriormente con o-cresol en una reacción de conjugación oxidativa catalizada por sulfato de cobre, para formar un colorante indofenol. El cambio de absorbancia a la longitud de onda máxima del colorante (615 nm) se usa, a continuación, para determinar los niveles de acetaminofeno. Aunque este 50 procedimiento proporciona una detección rápida del acetaminofeno, está sometido a interferencia significativa en presencia de niveles terapéuticos de NAC y no puede usarse con fiabilidad durante el tratamiento con NAC. Un procedimiento similar que utiliza o-cresol en presencia de un catalizador oxidante es propenso a mostrar interferencia con la bilirrubina (Bertholf y col., 2003) , lo que lleva a resultados falsos positivos en pacientes hiperbilirrubinémicos.

Morris y col.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

hidrolizar el acetaminofeno para formar p-aminofenol;

conjugar de forma oxidativa el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol usando un segundo reactivo (R2) que comprende el cromóforo xilenol en presencia de un catalizador adecuado para formar un producto coloreado y

determinar la cantidad del producto coloreado formado, siendo la cantidad del producto coloreado proporcional a la cantidad de acetaminofeno inicialmente presente en la muestra, en el que el paso de hidrólisis del acetaminofeno a p-aminofenol comprende poner en contacto el acetaminofeno con 15 un primer reactivo (R1) que comprende una aril acilamidasa, y en el que el catalizador es MnCl2.anhidro o hidratado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cromóforo de xilenol se selecciona a partir del 20 grupo compuesto por 2, 5-dimetilfenol, 2, 6-dimetilfenol y 2, 3-dimetilfenol.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el cromóforo de xilenol es 2, 5-dimetilfenol.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es una muestra acuosa, preferiblemente suero o plasma.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R1 comprende aril acilamidasa a una concentración de aproximadamente 10 U/l a aproximadamente 5000 U/l.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el catalizador está presente en R1 a una concentración de aproximadamente 0, 0005 g/l a aproximadamente 1, 000 g/l.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R2 comprende 2, 5

dimetilfenol a una concentración de aproximadamente 0, 075 g/l a aproximadamente 115 g/l y/o en el que el catalizador es MnCl2.4H2O y está presente en R1 en una concentración de aproximadamente 2, 5 g/l a aproximadamente 20 g/l.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R2 además 40 comprende glutatión reducido a una concentración de aproximadamente 0, 005 g/l a aproximadamente 5, 000 g/l.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R1 además comprende uno o más de entre un solubilizador de proteínas, un estabilizador de proteínas, un estabilizador de enzimas, un quelante de metales, un tampón, un agente tensioactivo, un agente para ajustar el pH, un conservante o 45 un excipiente.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el estabilizador de enzimas se selecciona a partir del grupo compuesto por PVP-40, fracción V de la BSA, trehalosa, p-hidroxibenzoato sódico, ácido p-hidroxibenzoico y combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el R2 además comprende uno o más de entre un tampón, un agente tensioactivo, un agente para ajustar el pH, un conservante, un antioxidante o un excipiente.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R1 además comprende un diluyente y el diluyente es agua desionizada, y la solución de hidrólisis se diluye aproximadamente 1:1 con el diluyente antes de la reacción de hidrólisis 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R1 comprende 19

aproximadamente 932, 7 U/l de aril acilamidasa y aproximadamente 0, 0525 g/l de MnCl2.4H2O; y en el que R2 comprende aproximadamente 7, 5 g/l de 2, 5-dimetilfenol y aproximadamente 0, 500 g/l de glutatión reducido.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada una de las reacciones de hidrólisis y conjugación oxidativa se produce a una temperatura de aproximadamente 37º C durante aproximadamente 3 a 10 minutos, y en el que la reacción de hidrólisis se produce a un pH de aproximadamente 8, 6 y la reacción de conjugación oxidativa se produce a un pH de aproximadamente 10, 8.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de acetaminofeno se determina obteniendo la diferencia en la absorbancia al final de la reacción de hidrólisis y al final de la reacción de conjugación oxidativa; y comparando la diferencia frente a un patrón o conjunto de patrones, en el que la absorbancia se mide a una longitud de onda de aproximadamente 610 nm y 665 nm.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la absorbancia se mide a una longitud de onda de 15 aproximadamente 660 nm.

17. Un kit para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra, comprendiendo el kit:

un primer recipiente que contiene un primer reactivo (R1) ; y un segundo recipiente que contiene un segundo reactivo (R2) , en el que R1 es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 9, 10, 13 o 14; y R2 es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 7, 8, 11 o13.

18. Un kit según la reivindicación 17 que además comprende instrucciones para realizar un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 14 a 16.