Embriogénesis somática de Jatropha curcas a partir de óvulos.

Un método para regenerar Jatropha mediante embriogénesis somática que comprende las etapas:

(a) cultivar un explante de Jatropha en un primer medio que comprende medio basal MS y ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) en la oscuridad para inducir la formación de callos embriogénicos, en donde el explante de Jatropha es un óvulo diseccionado de un botón floral sin abrir;

(b) cultivar los callos embriogénicos en el primer medio en un fotoperiodo de luz/oscuridad para inducir el desarrollo y maduración del embrión somático; y

(c) cultivar los embriones somáticos maduros en un segundo medio que comprende medio basal MS, ácido indol- 3-butírico (IBA) y ácido giberélico (GA3) en un fotoperiodo de luz/oscuridad para germinar las plántulas.

Embriogénesis somática de Jatropha curcas a partir de óvulos

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de la producción de embriones somáticos, en concreto, a métodos para la embriogénesis somática de Jatropha a partir de óvulos. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método y composiciones de medios para la embriogénesis somática de Jatropha curcas a partir de óvulos de botones florales no abiertos. El método es adecuado para la transformación de Jatropha curcas, para producir un stock clónico de plantas útil para plantación a gran escala de Jatropha curcas y para producir haploides, dobles haploides, diploides y plántulas libres de enfermedades.

Las publicaciones y otros materiales usados en el presente documento para ilustrar los antecedentes de la invención o para proporcionar detalles adicionales respecto de la puesta en práctica, por conveniencia, están agrupados respectivamente en la Bibliografía.

Jatropha curcas, que pertenece a la familia de las Euforbiáceas, es una planta cuyo origen se encuentra en América Latina, ampliamente dispersa por todas las regiones tropicales áridas y semiáridas del mundo. Jatropha es un género extenso que comprende más de 170 especies. Las especias más comunes en India son J. curcas, J. gossypifolia, J. multifida, J. nana, J. panduraefolia, J. villosa y J. podagrica. J. curcas es un árbol pequeño o arbusto con corteza gris suave, que exuda un látex acuoso de color blanquecino cuando se corta. Normalmente, crece hasta una altura de entre tres y cinco metros, pero puede alcanzar una altura de hasta ocho o diez metros en condiciones favorables. Es una planta resistente a las sequías, que vive hasta 50 años y crece en tierras marginales.

J. curcas tiene hojas grandes de color verde a verde pálido, que se alinean alternas sub opuestas. Las hojas son de tri a penta lobuladas con filotaxis en espiral. El peciolo de las flores varía entre 6-23 mm de longitud. Las flores se forman en las estaciones cálidas. Se forman varios cultivos siempre que el suelo sea húmedo, bueno y las temperaturas elevadas. En condiciones donde sucede un crecimiento continuo, un desequilibrio en la producción de flor pistilada o estaminada da como resultado un mayor número de flores hembra. Los frutos se producen en invierno, cuando el arbusto se encuentra sin hojas. Cada inflorescencia produce un ramo de aproximadamente 10 o más frutos ovoides. Se forman tres cocos bivalvos después de que las semillas maduren y el exocarpo carnoso se seca. Las semillas han alcanzado la madurez cuando la cápsula cambia de verde a amarillo, de dos a cuatro meses después de la fertilización. Las semillas negruzcas de cáscara delgada son oblongas y se asemejan a las semillas de la linaza. Esta planta tiene varios usos medicinales, especialmente en productos nutracéuticos, farmacéuticos, dermatológicos y de cuidado personal. El látex de Jatropha curcas tiene propiedades anti cancerígenas debido a la presencia de un alcaloide conocido como "jatropina". Los tallos tiernos se usan para lavarse los dientes. El jugo de las hojas se usa aplicado externamente para las hemorroides. Las raíces se usan como antídoto para mordeduras de serpiente. Las semillas se usan con propósitos antihelmínticos. La corteza produce un tinte azul oscuro usado para teñir tejidos, redes y líneas de pesca. La mayor parte de las especies de Jatropha son ornamentales a excepción de J. curcas y J. glandulifera que son especies productoras de aceite. Las semillas de estas especies contienen aceite semi-seco que se ha demostrado útil para propósitos medicinales y veterinarios.

El contenido en aceite es del 25-30 % en las semillas y del 50-60 % en el germen. El aceite contiene un 21 % de 45 ácidos grasos saturados y un 79 % de ácidos grasos insaturados. El aceite de Jatropha contiene ácido linoleico (C18:2) y ácido oleico (C18:1) que en conjunto forman hasta un 80 % de la composición del aceite. El ácido palmítico (C16:0) y el ácido esteárico (C18:0) son otros ácidos grasos presentes en este aceite. El aceite no es comestible, sin embargo, tiene el potencial de proporcionar una alternativa prometedora y comercialmente viable al combustible diesel ya que tiene todas las propiedades fisicoquímicas y de rendimiento deseables del combustible diesel. La planta J. curcas ha atraído últimamente una atención particular como planta energética tropical. El aceite de la semilla puede usarse como combustible para motores diesel ya que tiene características similares a las del combustible fósil para motores diesel. Además, debido a su naturaleza no tóxica y biodegradable, el biodiesel de Jatropha cumple con los estándares europeos de la norma EN 14214 de combustibles puros y mezclados para motores diesel. La semilla de Jatropha curcas rinde aproximadamente 6-8 TM/ha con aproximadamente un 37 % de 55 aceite. Dicho rendimiento puede producir el equivalente a 2100-2800 litros de combustible/ha, cuya energía es equivalente a 19.800/26.400 KWh/ha (Gaydou et al., 1982) . Debido a su elevado valor de saponificación y su capacidad de arder sin emitir humo, el aceite de las semillas es comercialmente útil. Por ejemplo, se usa extensivamente para producir jabón. Las preocupaciones económicas, medioambientales y de seguridad energética por todo el mundo fuerzan a cambiar de combustibles fósiles a alternativas de biocombustible como el bioetanol y el biodiesel. Ya que los biocombustibles pueden producirse a partir de un amplio conjunto de cultivos, cada país está adoptando una estrategia que explote las ventajas comparativas que se sustentan en determinadas cosechas.

Entre los distintos cultivos de biocombustible, se considera que Jatropha curcas es un mejor candidato para la producción de biocombustible debido a sus factores fisiológicos y naturales. El interés intenso en el aceite de 65 Jatropha curcas ha generado una enorme presión para proveer de suficientes semillas que sean homogéneas y lo suficientemente productivas para plantación. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para propagar en masa

árboles de élite. Son igualmente urgentes métodos par mejorar varias características agronómicas de Jatropha curcas. La ingeniería genética se encuentra reconocida como un método rápido para la mejora de cultivos. La transformación de plantas es esencialmente un proceso en dos etapas, es decir, dispensación de los genes dentro de una célula hospedadora seguido de la regeneración de la célula transformada en una planta. Los callos somáticos embriogénicos o cultivos somáticos embriogénicos en suspensión se consideran como el método de regeneración más eficiente ya que la mayor parte de las células transformadas ya han adquirido el potencial embriogénico que hará que se desarrollen en un embrión somático de manera prácticamente espontánea, un proceso similar a un óvulo fertilizado en un embrión cigótico (Dodeman, et al., 1997) .

Los embriones somáticos son adecuados para transformación vía Agrobacterium tumefaciens (Mathews et al., 1992) , microinyección (Neuhaus et al., 1987) y bombardeo con partículas (Wilde et al., 1992) . Además, los embriones somáticos o los callos embriogénicos somáticos pueden criopreservarse usando nitrógeno líquido sin pérdida de viabilidad. Estos son materiales ideales para el mantenimiento del plasma germinal así como de la embriogenicidad celular.

Los embriones somáticos son de origen clónico y por tanto la multiplicación usando embriones somáticos puede tener un potencial de tasas elevadamente altas de aumento vegetativo y es por tanto de un interés comercial considerable. La regeneración a través de embriogénesis somática es una opción atractiva para el cultivo de tejidos de plantas. Según se ha informado, los embriones somáticos proporcionan más regenerantes estables que los brotes. Otra ventaja de los sistemas de regeneración usando embriones somáticos es su origen celular único aparente. Esto significa que es improbable que los regenerantes sean de origen quimérico, ya que, si se origina un regenerante de un grupo de células en vez de una única célula, los tejidos de la planta pueden ser quiméricos o inestables y producir plantas fuera de tipo.

Para mejorar adicionalmente este cultivo, pueden utilizarse técnicas biotecnológicas como cultivos tisulares y transformación. Durante las dos últimas décadas se han documentado varios informes acerca de la regeneración de Jatropha usando varios explantes y varias composiciones de medios. Estos informes incluyen la regeneración de plantas a partir del hipocótilo, peciolo y explantes foliares (Sujatha y Mukta, 1996) , explantes de epicótilo (Solicitud de Patente de China Nº 200610020449.X) , discos foliares (Publicación... [Seguir leyendo]

1. Un método para regenerar Jatropha mediante embriogénesis somática que comprende las etapas:

(a) cultivar un explante de Jatropha en un primer medio que comprende medio basal MS y ácido 2, 4diclorofenoxiacético (2, 4-D) en la oscuridad para inducir la formación de callos embriogénicos, en donde el explante de Jatropha es un óvulo diseccionado de un botón floral sin abrir;

(b) cultivar los callos embriogénicos en el primer medio en un fotoperiodo de luz/oscuridad para inducir el desarrollo y maduración del embrión somático; y

(c) cultivar los embriones somáticos maduros en un segundo medio que comprende medio basal MS, ácido indol3-butírico (IBA) y ácido giberélico (GA3) en un fotoperiodo de luz/oscuridad para germinar las plántulas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la duración del cultivo es:

de aproximadamente 30 días a aproximadamente 60 días en el primer medio para inducir la formación de callos embriogénicos; de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente seis semanas en el primer medio para desarrollar y madurar los embriones somáticos; y de aproximadamente una semana a aproximadamente tres semanas en el segundo medio para germinar las plántulas.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la duración de cultivo en cada medio es:

aproximadamente 40 días en el primer medio para inducir la formación de callos embriogénicos; 25 aproximadamente cuatro semanas en el primer medio para desarrollar y madurar los embriones somáticos; y aproximadamente dos semanas en el segundo medio para germinar las plántulas.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la duración del cultivo es:

de aproximadamente 30 días a aproximadamente 60 días en el primer medio para inducir la formación de callos embriogénicos; de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente seis semanas en el primer medio con subcultivo aproximadamente cada dos semanas para desarrollar y madurar embriones somáticos; y de aproximadamente una semana a aproximadamente tres semanas en el segundo medio con subcultivo aproximadamente cada dos semanas para germinar las plántulas.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la duración del cultivo en cada medio es:

aproximadamente 40 días en el primer medio para inducir la formación de callos embriogénicos; aproximadamente cuatro semanas en el primer medio para desarrollar y madurar los embriones somáticos maduros; y aproximadamente dos semanas en el segundo medio para germinar las plántulas.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el segundo medio contiene además una o más citoquininas, uno o más 45 aditivos orgánicos o una mezcla o una o más citoquininas y uno o más aditivos orgánicos.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la citoquinina es quinetina (KN) , 6-bencilaminopurina (BA) , tidiazurón (TDZ) o mezclas de los mismos.

8. El método de la reivindicación 6, en donde el aditivo inorgánico es hidrolizado de caseína (CH) , sulfato de adenina (AdSO4) o mezclas de los mismos.

9. El método de la reivindicación 6, en donde (a) la citoquinina es quinetina (KN) , 6-bencilaminopurina (BA) ,

tidiazurón (TDZ) o mezclas de los mismos y (b) el aditivo orgánico es hidrolizado de caseína (CH) , sulfato de 55 adenina (AdSO4) o mezclas de los mismos.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el medio comprende:

primer medio; medio basal MS y de aproximadamente 2, 26 ï?­M a aproximadamente 9, 04 ï?­M de 2, 4-D; y segundo medio: medio basal MS, de aproximadamente 1, 23 ï?­M a aproximadamente 4, 92 ï?­M de IBA y de aproximadamente 0, 72 ï?­M a aproximadamente 5, 76 ï?­M de GA3.

11. El método de la reivindicación 10, en donde los medios comprenden:

primer medio: medio basal MS y aproximadamente 6, 78 ï?­M de 2, 4-D; y 14

segundo medio: medio basal MS, aproximadamente 2, 46 μM de IBA y aproximadamente 2, 88 μM de GA3.

12. El método de la reivindicación 7, en donde la concentración de las una o más citoquininas es:

(a) de aproximadamente 1, 16 μM a aproximadamente 9, 28 μM de KN;

(b) de aproximadamente 1, 10 μM a aproximadamente 8, 86 μM de BA;

(c) de aproximadamente 1, 13 μM a aproximadamente 9, 08 μM de TDZ;

(d) de aproximadamente 1.16 μM a aproximadamente 4, 64 μM de KN y de aproximadamente 1, 10 μMa aproximadamente 4.43 μM de BA;

(e) de aproximadamente 1, 10 μM a aproximadamente 4, 43 μM de BA y de aproximadamente 1, 13 μMa aproximadamente 4, 54 μM de TDZ: o

(f) de aproximadamente 1, 16 μM a aproximadamente 4, 64 μM de KN y de aproximadamente 1, 13 μMa aproximadamente 4, 54 μM de TDZ.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la concentración de las una o más citoquininas es:

(a) aproximadamente 4, 64 μM de KN;

(b) aproximadamente 4, 43 μM de BA;

(c) aproximadamente 4, 54 μM de TDZ;

(d) aproximadamente 2, 32 μM de KN y aproximadamente 2, 21 μM de BA;

(e) aproximadamente 2, 21 μM de BA y aproximadamente 2, 27 μM de TDZ; o

(f) aproximadamente 2, 32 μM de KN y aproximadamente 2, 27 μM de TDZ.

14. El método de la reivindicación 8, en donde la cantidad de aditivo orgánico es:

(a) de aproximadamente 0, 25 g a aproximadamente 1, 0 g de CH;

(b) de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg de AdSO4; o

(c) de aproximadamente 0, 25 g a aproximadamente 1, 0 g de CH y de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg de AdSO4.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la cantidad de aditivo orgánico es:

(a) aproximadamente 1, 0 g de CH;

(b) aproximadamente 100 mg de AdSO4; o

(c) aproximadamente 1, 0 g de CH y aproximadamente 100 mg de AdSO4.

16. El método de la reivindicación 9, en donde

(a) la concentración de las una o más citoquininas es:

(i) de aproximadamente 1, 16 μM a aproximadamente 9, 28 μM de KN;

(ii) de aproximadamente 1, 10 μM a aproximadamente 8, 86 μM de BA:

(iii) de aproximadamente 1, 13 μM a aproximadamente 9, 08 μM de TDZ;

(iv) de aproximadamente 1, 16 μM a aproximadamente 4, 64 μM de KN y de aproximadamente 1, 10 μMa aproximadamente 4, 43 μM de BA;

(v) de aproximadamente 1, 10 μM a aproximadamente 4, 43μM de BA y de aproximadamente 1, 13 μMa aproximadamente 4, 54 μM de TDZ; o

(vi) de aproximadamente 1, 16 μM a aproximadamente 4, 64 μM de KN y de aproximadamente 1, 13μMa aproximadamente 4, 54 μM de TDZ; y

(b) la cantidad del aditivo orgánico es:

(i) de aproximadamente 0, 25 g a aproximadamente 1, 0 g de CH;

(ii) de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg de AdSO4; o

(iii) de aproximadamente 0, 25 g a aproximadamente 1, 0 g de CH y de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg de AdSO4.

17. El método de la reivindicación 16, en donde (a) la concentración de las una o más citoquininas es:

(i) aproximadamente 4, 64 μM de KN;

(ii) aproximadamente 4, 43 μM de BA;

(iii) aproximadamente 4, 54 μM de TDZ;

(iv) aproximadamente 2, 32 ï?­M de KN y aproximadamente 2, 21ï?­M de BA;

(v) aproximadamente 2, 21ï?­M de BA y aproximadamente 12, 27 ï?­M de TDZ; o

(vi) aproximadamente 2, 32 ï?­M de KN y aproximadamente 2, 27 ï?­M de TDZ; y

(b) la cantidad de aditivo orgánico es:

(i) aproximadamente 1, 0 g de CH;

(ii) aproximadamente 100 mg de AdSO4; o

(iii) aproximadamente 1, 0 g de CH y aproximadamente 100 mg de AdSO4. 10

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en donde los medios comprenden:

primer medio: medio basal MS y de aproximadamente 2, 26 ï?­M a aproximadamente 9, 04 ï?­M de 2, 4-D; y segundo medio: medio basal MS, de aproximadamente 1, 23 ï?­M a aproximadamente 4, 92 ï?­M de IBA y de 15 aproximadamente 0, 72 ï?­M a aproximadamente 5, 76 ï?­M de GA3.

19. El método de la reivindicación 18, en donde los medios comprenden:

primer medio: medio basal MS y aproximadamente 6, 78 ï?­M de 2, 4-D; y 20 segundo medio: medio basal MS, aproximadamente 2, 46 ï?­M de IBA y aproximadamente 2, 88 ï?­M de GA3.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada medio comprende además una fuente de carbono, en donde la fuente de carbono se selecciona preferentemente del grupo que consiste en sacarosa, glucosa, fructosa, maltosa, una mezcla de sacarosa y glucosa, una mezcla de fructosa y glucosa y una mezcla de maltosa y glucosa.

21. El método de la reivindicación 20, en donde la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 % de sacarosa, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 % de glucosa, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 % de fructosa, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 % de maltosa, una mezcla de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 % de sacarosa y de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 % de glucosa, una mezcla de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 % de fructosa y de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 % de glucosa y una mezcla de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 % de maltosa y de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 % de glucosa.

22. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso (a1) después del paso (a) y antes del paso (b) en donde el paso (a1) comprende tratar el callo embriogénico con un inhibidor mitótico para inducir la duplicación de cromosomas, en donde el inhibidor mitótico se selecciona del grupo que consiste en colchicinas y orizalina.

23. El método de la reivindicación 22, en donde los callos embriogénicos se tratan con entre un 0, 1 % a 0, 5 % del inhibidor mitótico.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, en donde los callos embriogénicos se tratan durante un periodo de un día a tres días. 45