Diagnóstico de paraplejias espásticas hereditarias (PEH) por detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840.

Un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD),

en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina), en comparación con una población de control, en el que dicha mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD).

Diagnóstico de paraplejias espásticas hereditarias (PEH) por detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840.

[0001] La invención se refiere a la identificación de mutaciones en el gen o la proteína KIAA1840, asociadas con paraplejias espásticas hereditarias (PEH) , y a las aplicaciones diagnósticas que se benefician de esta identificación.

[0002] Las paraplejias espásticas hereditarias (PEH) son trastornos mendelianos genéticamente 10 heterogéneos caracterizados por debilidad, espasticidad y pérdida de sentido de la vibración en las extremidades inferiores (Harding y col. 1983 y Tallaksen y col. 2001) . Se revelan clínicamente por dificultades en la deambulación que evolucionan posiblemente hacia parálisis total de las dos piernas. La fisiopatología de este grupo de enfermedades se encuentra, hasta la fecha, relativamente mal documentada; sin embargo, los datos anatomopatológicos hacen posible concluir que el ataque se limita a los tractos piramidales responsables de la 15 motricidad voluntaria en la médula espinal (Reid, 1997) . La incidencia de PEH, que sigue siendo difícil de estimar debido a la escasez de estudios epidemiológicos y a la considerable variabilidad clínica, se sitúa en 0, 9:100.000 en Dinamarca, de 3 a 9, 6:100.000 en algunas regiones de España (Polo y col., 1991) o en 14:100.000 en Noruega (Skre, 1974) (aproximadamente 3:100.000 en Francia) . Existen varias formas clínicas y genéticas de PEH. Las denominadas PEH "puras", que corresponden a espasticidad aislada de las extremidades inferiores, se distinguen 20 clínicamente de las PEH "complejas", para las cuales la espasticidad de las piernas se asocia con otros signos clínicos de tipo neurológico o no neurológico (Bruyn y col., 1991) .

[0003] Aunque se han reconocido formas de PEH desde hace más de un siglo, regularmente se describen nuevos fenotipos, lo que revela una amplia heterogeneidad clínica. Genéticamente, se observan formas autosómicas 25 dominantes (AD) , autosómicas recesivas (AR) y ligadas al cromosoma X y se han identificado casi 32 locus genéticos, aunque sólo se han clonado 12 genes (Flink y col. 2006) . De acuerdo con las posibles funciones de estos genes, en la degradación de los axones de los tractos piramidales en estos trastornos se ha implicado el plegamiento de proteínas y el transporte axonal.

[0004] Las formas más comunes de PEH-AD, que suponen aproximadamente el 40-50% de los casos, son causadas por mutaciones en los genes SPG4 y SPG3A que codifican la espastina y la atlastina, respectivamente (Hazan y col. 1990, Zhao y col. 2001 y solicitud de patente internacional WO-01/18.198) . A diferencia de las formas AD, la PEH-AR no se le se asocia ningún gen principal, lo que es menos habitual y más variado en presentación clínica, e implica una mayor heterogeneidad genética. Los cuatro genes de PEH-AR clonados hasta ahora, que 35 codifican la paraplejina (SPG7, MIM#607259 (base de datos OMIM, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/quer y .fcgi?db=OMIM) ) (Casari y col. 1998) , la espartina (SPG20; MIM#275900) , (Patel y col. 2002) y la maspardina (SPG21, MIM 248900) (Simpson y col. 2003) , así como el gen responsable de la dolencia relacionada conocida como ataxia espástica de Charlevoix-Saguenay (ARSACS, MIM#270550) (Engert y col. 2000) , representan probablemente menos del 5% de todos los casos (Fink y col. 2003) . 40

[0005] Una forma muy común de PEH-AR se asocia a paraplejia espástica, déficit mental o cognitivo y cuerpo calloso delgado (Winner y col. 2005) . La mayoría de las familias parecen tener ligamiento a SPG11 en el cromosoma 15, que fue el tercer locus de PEH-AR identificado (Martinez y col. 1999) . Esta entidad es especialmente prevalente en Japón (Shibasaki y col. 2000) , pero también se encuentra en Norteamérica, Oriente Medio y Europa (Martinez y 45 col. 1999 y Lossos y col. 2006 y Casali y col. 2004 y Winner y col. 2004 y Stevanin y col. 2006) . Las características clínicas típicas de SPG11 consisten en paraplejia espástica de inicio temprano (normalmente <20 años) , disfunción de la vejiga urinaria, déficits sensoriales profundos en las piernas y deterioro cognitivo que progresa insidiosamente a discapacidad funcional grave durante un periodo de 10-20 años. Algunos pacientes desarrollan también afectación en los brazos, disartria, contracturas y atrofia muscular. Los estudios auxiliares identifican frecuentemente un cuerpo 50 calloso delgado (CCD) con lesiones en la materia blanca y atrofia cortical cerebral variable en la resonancia magnética (RM) , hipometabolismo de la glucosa cortical y talámico variable en tomografía por emisión de positrones y neuropatía periférica motora o sensorimotora predominantemente axonal en estudios de conducción nerviosa (Winner y col. 2004) .

[0006] Hasta ahora se ha comunicado ligamiento al cromosoma 15q en 31 familias en las que los pacientes presentaban el fenotipo SPG11 típico. En el estudio inicial, se detectó una puntuación LOD multipunto combinada máxima de 3, 14 en siete familias con PEH-AR en una región entre D15S1007 y D15S1012, aunque sólo los pacientes de 2 grupos de ascendencia norteamericana e italiana presentaron CCD (Martinez y col. 1999) . Un

segundo estudio comunicó un grupo de 10 entre 13 familias japonesas con un fenotipo homogéneo de PEH-AR-CCD con una puntuación LOD acumulada de 9, 68 en el intervalo de D15S971 a D15S117 (Shibasaki y col. 2000) . Casali y col. también comunicaron 5 grupos de ascendencia italiana que mostraron un ligamiento significativo (Z = 3, 35) con el intervalo flanqueado por los marcadores D15S1007 y D15S978 (Casali y col. 2004) . Más recientemente, el análisis de 8 grupos de ascendencia adicionales (Z = 11, 5) que incluía 3 grandes familias consanguíneas, permitió 5 limitar el locus, por los autores de la invención, al intervalo de 6 cM entre los marcadores D15S1044 y D15S143 (Lossos y col. 2006 y Stevanin y col. 2006) , una región que no se solapaba con el intervalo definido en las familias estudiadas originalmente (Martinez y col. 1999) , lo que mostraba por tanto heterogeneidad genética entre familias con ligamiento al 15q y que se asemeja más estrechamente al locus para esclerosis lateral amiotrófica ALS5 (Hentati y col., 1998) . Debe observarse que en el trabajo publicado por Martinez y col. (1999) , sólo 2 de 8 árboles 10 genealógicos presentaron el fenotipo SPG11 típico con CCD y los pacientes de estas 2 familias mostraban ligamiento con una región mayor en el cromosoma 15 que se solapaba con la región descrita en informes recientes (Lossos y col. 2006 y Stevanin y col. 2006) . Más recientemente, el locus de SPG11 fue redefinido adicionalmente en la región de 4, 6 cM (según el mapa genético de Marschfield, http://research.marshfieldclinic.org/genetics/GeneticResearch/compMaps.asp) entre los marcadores D15S968-15 D15S132 (Olmez y col., 2006) lo que confirma los resultados de los autores de la invención (figura 2) .

[0007] Los autores de la invención han identificado ahora el gen responsable de la forma más frecuente de paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva (PEH-AR) . De hecho han demostrado que la enfermedad está causada por mutaciones en el gen KIAA1840 (también conocido como FLJ21439) , lo que afecta a la expresión de la 20 proteína espatacsina (Stevanin y col., 2007) . Esta conclusión está respaldada por cuatro elementos de evidencia. En primer lugar, los autores de la invención han excluido 17 de aproximadamente 40 genes asignados al intervalo candidato de SPG11 después de una reducción significativa de su tamaño al intervalo de 3, 2 cM (según el mapa genético de Marschfield) entre los marcadores D15S778 y D15S659 (figuras 1 a 4) . El análisis de 2 de estos genes ha sido referido anteriormente (Stevanin y col., 2006) . En segundo lugar, los autores de la invención han identificado 25 43 mutaciones diferentes que se segregan en 47 familias (figuras 5 a 9) , en 16 de las cuales se había detectado anteriormente ligamiento con el locus de SPG11 con una puntuación LOD máxima de 28, 1 altamente significativa (figuras 1 y 2) , 8 de ellas ya publicadas como poseedoras de ligamiento (Casali y col., 2004; Lossos y col., 2006 y Stevanin y col., 2006) . En tercer lugar, los autores de la invención han identificado mutaciones, ausentes en al menos 140 cromosomas de control, que todas ellas, condujeron a un empalme anómalo del ARN mensajero y/o que 30 condujeron a una proteína truncada. Finalmente, los autores de la invención han demostrado que todas las familias con mutaciones, excepto 2 en las que no pudo realizarse resonancia magnética (TUN2 y TUN14) , presentaban el fenotipo de PEH-AR-CCD típico. Además, varias de estas familias compartían la misma mutación con haplotipos circundantes similares cuando procedían del... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD) , en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina) , en comparación con una población de 5 control, en el que dicha mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD) .

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa que consiste en la detección de una mutación de KIAA1840 en una muestra de ácidos nucleicos obtenida a partir del sujeto, en comparación con 10 una población de control, en el que la presencia de una mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD) .

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha mutación de KIAA1840 se selecciona entre el grupo que consiste en: 15

- las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951 C>T, c.5974C>T,

- las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y 20

- las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1. 25

4. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa que consiste en la detección de una mutación en la proteína KIAA1840 o en la detección de una forma truncada de la proteína KIAA1840 contenida en una muestra obtenida a partir del sujeto, en comparación con una población de control, en el que la presencia de una mutación en la proteína KIAA1840 o de una forma truncada de la proteína KIAA1840 es indicativa de una 30 paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD) .

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que se usa un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce la proteína KIAA1840 de tipo natural para detectar la presencia de la proteína de tipo natural o una de sus formas truncadas. 35

6. El procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que la proteína KIAA1840 truncada se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 149 a SEQ ID NO: 164.

7. Un ácido nucleico aislado que puede hibridarse específicamente en una región de la secuencia del 40 gen KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en

- las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

- las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, 45 c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

- las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que dicho ácido nucleico es complementario de una región de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene 50 una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en:

- las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

- las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, 55 c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

- las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

8. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 7 en el que dicho ácido nucleico puede hibridarse específicamente en una región que consiste en 10 nucleótidos en la dirección 5’ y 10 nucleótidos en la dirección 3’ 5 de la mutación seleccionada.

9. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 7 u 8, que consiste en al menos 20 nucleótidos.

10. El uso de un ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 como un cebador o 10 una sonda.

11. Un ácido nucleico aislado, que comprende o consiste en una secuencia del gen KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en

- las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

- las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

- las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG o una secuencia complementaria de las

mismas;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y 25

en el que dicho ácido nucleico consiste en al menos 10 nucleótidos.

12. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, 30 p.K401KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.I2246_E2247delfsX2260, p.S2278LfsX2338 y p.V2344CfsX2349;

en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2.

13. Un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado que reconoce específicamente una proteína KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.I177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, p.K401KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.I2246_E2247delfsX2260, p.S2278LfsX2338 y p.V2344CfsX2349; 40

en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2,

en el que dicho anticuerpo no realiza reacción cruzada con la proteína KIAA1840 de tipo natural. 45