Detección y visualización del ciclo celular en células vivas.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA),

comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que se desvía de la SEC ID N.º por sustitución conservadora de uno o más aminoácidos en la posición 1 a 28, 38 a 52, 63 a 98 y 115 a 123 de la SEC ID NO: 2.

Detección y visualización del ciclo celular en células vivas La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) , comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos que se desvía de la SEC ID NO: 2 por sustitución conservadora de uno o más aminoácidos en la posición 1 a 28, 38 a 52, 63 a 98 y 115 a 123 de la SEC ID NO: 2. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, a una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector de la invención y a un procedimiento de detección de la cantidad y/o ubicación del PCNA en células vivas, así como a un procedimiento de detección selectiva de compuestos que tienen un efecto sobre el ciclo celular.

Los anticuerpos son herramientas valiosas para identificar y visualizar estructuras celulares. Sin embargo, la aplicación de anticuerpos de origen natural para la detección de antígenos intracelulares requiere la permeabilización (y a menudo la fijación) de las células. Además, la detección basada en anticuerpos de antígenos dentro de células intactas se evita esencialmente por el hecho de que los anticuerpos están, por naturaleza, diseñados para funcionar en un entorno oxidante (extracelular) : la reducción del ambiente en el citoplasma conduce a una alteración de la formación de puentes disulfuro, que da lugar a un ensamblaje ineficiente de las partes que reconocen el epítopo de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada (Biocca et al. (1990) ; Cattaneo et al. (1999) . Únicamente en unos pocos casos, los anticuerpos intracelulares (AcIC) se han utilizado para afectar a la función de las proteínas in vivo, pero aún se sabe poco sobre sus propiedades en las células vivas (Biocca et al. (1993) ; Biocca et al. (1990) ; Marasco et al. (1998) ; Cardinale et al. (1998) ; Kontermann (2004) .

En un intento por evitar los problemas asociados con la aplicación de anticuerpos en el citoplasma de células intactas, en el pasado se ha estudiado la expresión proteica mediante la fusión de proteínas de interés a proteínas fluorescentes tales como GFP (“marcaje con GFP”) . El marcaje de proteínas con proteínas fluorescentes se ha convertido en un procedimiento extremadamente popular para estudiar el tráfico intracelular de proteínas y en combinación con técnicas de fotoblanqueo con fluorescencia, ha proporcionado información única sobre la dinámica de las proteínas en células vivas. No obstante, solo se puede medir la dinámica de las proteínas quiméricas, mientras que las proteínas auténticas, sus modificaciones postraduccionales así como los componentes no proteináceos de la célula no se pueden evaluar mediante los procedimientos disponibles. Adicionalmente, la mayoría de estos enfoques dan como resultado la agregación de la proteína de fusión en la célula, es decir en una ubicación y/o expresión que no corresponde a la ubicación y/o expresión naturales de la proteína (Chalfie y Kain, 2005; Leonhardt et al., 1998) .

En los últimos tiempos, la exploración del ciclo celular y los procesos que intervienen en el mismo ha ganado cada vez más interés. Además de la detección visual de las diferentes fases del ciclo celular usando microscopia óptica, procedimientos aplicados habitualmente para estudiar el ciclo celular comprenden la tinción de los cromosomas que implica la fijación de las células y la tinción del núcleo con colorantes fluorescentes tales como DAPI que no es útil para rastrear proteínas específicas implicadas en el ciclo celular.

Para superar estas limitaciones, sería deseable generar aglutinantes proteicos detectables que eviten los problemas y limitaciones de los anticuerpos de origen natural y establecer su aplicación en la célula viva preferentemente evitando la interferencia con los procesos celulares. Estos aglutinantes serían preferentemente útiles para rastrear las diferentes etapas del ciclo celular y proteínas específicas.

De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) , comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos que se desvía de la SEC ID Nº por sustitución conservadora de uno o más aminoácidos en la posición 1 a 28, 38 a 52, 63 a 98 y 115 a 123 de la SEC ID NO: 2. Ejemplos de tales polipéptidos que comprenden sustituciones conservadoras de uno o más aminoácidos en una o dos regiones marco están representados por las SEC ID Nº s: 16 y 18.

La expresión "molécula de ácido nucleico" tal como se usa indistintamente con el término "polinucleótido", de acuerdo con la presente invención, incluye ADN, tal como ADNc o ADN genómico y ARN tal como ARNm. Se incluyen además moléculas que imitan al ácido nucleico conocidas en la técnica tales como derivados sintéticos o semisintéticos de ADN o ARN y polímeros mixtos siempre y cuando se puedan introducir y expresar en una célula. Las moléculas de ácido nucleico pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivadas adicionales, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica.

La expresión "que se une de forma específica", de acuerdo con la presente invención se refiere a la propiedad de los polipéptidos de la invención de tener una afinidad por proteínas específicas, es decir, proteínas diana, que es mayor por un factor de al menos 10, preferentemente de al menos 100, más preferentemente de al menos 1.000 y lo más preferentemente de al menos 10.000 en comparación con la afinidad por proteínas no relacionadas con la proteína

diana. La proteína diana del polipéptido de la presente invención es PCNA.

La expresión "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de uno o más aminoácidos por otro aminoácido con propiedades físicas y químicas tales como el tamaño y la carga similares. La expresión es bien conocida en la técnica y en el presente documento se usa con el mismo significado. Ejemplos de sustituciones conservadoras son la sustitución de valina por leucina, de cisteína por serina, de glutamina con asparagina o de ácido aspártico por ácido glutámico o viceversa. En relación con la presente invención, las sustituciones conservadoras no alteran o esencialmente no alteran las propiedades del polipéptido de la invención tales como sus propiedades de unión y/o su comportamiento dentro de las células eucariotas. En el ejemplo de la actividad de unión al PCNA, el término "esencialmente" denota una actividad de unión de al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 % y lo más preferentemente al menos el 95 % en comparación con la del polipéptido de la invención que no comprende sustituciones de aminoácidos. En el ejemplo del comportamiento del polipéptido dentro de las células eucariotas, el término "esencialmente" denota por ejemplo, una expresión y/o distribución dentro de la célula que es comparable a la del polipéptido de la invención que no comprende sustituciones de aminoácidos.

Los aminoácidos desde la posición 1 a 28, 38 a 52, 63 a 98 y 115 a 123 de la SEC ID NO: 2 forman la región marco del polipéptido de la invención. En los ejemplos, se han determinado las regiones marco así como las regiones CDR que están implicadas en la unión del PCNA (véase la Figura 1) . Además de no interferir con la unión del polipéptido de la invención a PCNA, las sustituciones de aminoácidos se deben elegir de tal manera que no interfieran con el plegamiento correcto del polipéptido y que no alteren la estructura tridimensional del marco de modo que la unión al PCNA ya no sea posible.

A partir de la información divulgada en la presente solicitud y de su conocimiento común, el experto sabe qué aminoácidos se pueden sustituir y también conoce procedimientos para comparar las propiedades de un polipéptido que comprende una o más sustituciones de aminoácidos con los del polipéptido de la invención que no comprende ninguna sustitución de aminoácidos. Procedimientos ejemplares comprenden estudios de solubilidad, ensayos de formación de agregados, análisis de distribución, ensayos de unión y estudios de expresión en células eucariotas vivas.

Ejemplos del ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido con una o más sustituciones conservadoras en... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) , comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que se desvía de la SEC ID Nº por sustitución conservadora de uno o más aminoácidos en la posición 1 a 28, 38 a 52, 63 a 98 y 115 a 123 de la SEC ID NO: 2.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende o consiste en

(a) la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº s: 1, 15 o 17; o

(b) una secuencia de ácido nucleico degenerado con respecto a la secuencia de ácido nucleico de (a) .

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador peptídico o proteináceo visualmente detectable.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que dicho marcador peptídico o proteináceo detectable visualmente es un polipéptido fluorescente, en el que dicho polipéptido fluorescente se separa de dicho polipéptido que se une específicamente a PCNA por un enlazador de al menos un residuo de aminoácido.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4, en la que dicho polipéptido fluorescente es GFP, RFP o YFP.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 o 5, en la que el polipéptido que se une específicamente al PCNA se localiza en el extremo N de dicho polipéptido fluorescente.

7. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº s: 9, 11, 19 o 21 o que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste en las SEC ID Nº s: 10, 12, 20 o 22.

8. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7

o el vector de la reivindicación 8.

10. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Un procedimiento de producción de un polipéptido de la reivindicación 10 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 en condiciones adecuadas y aislar el polipéptido producido.

12. Un polipéptido

(a) codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que tiene un colorante fluorescente acoplado al mismo; o

(b) producido por el procedimiento de la reivindicación 11.

13. Un procedimiento de detección de la cantidad y/o localización del PCNA en una célula eucariota viva, que comprende

a. expresar en dicha célula el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7; y

b. detectar la emisión de fluorescencia de la parte fluorescente de dicho polipéptido en la célula tras la excitación;

en el que la ubicación de la emisión de fluorescencia de la parte fluorescente de dicho polipéptido en la célula es indicativa de la presencia de PCNA.

14. Un procedimiento de detección selectiva de compuestos que tienen un efecto sobre el ciclo celular que comprende

a. expresar en una célula eucariota el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7;

b. poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y

b. detectar la emisión de fluorescencia de la parte fluorescente de dicho polipéptido tras la excitación;

en el que un cambio en la cantidad y/o ubicación de la emisión de fluorescencia de la parte fluorescente de dicho polipéptido en la célula en comparación con la observada en una célula eucariota de referencia que expresa el

polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 y no en contacto con el compuesto de ensayo es indicativa de que el compuesto tiene un efecto sobre el ciclo celular.

15. Uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el vector de la reivindicación 8, la célula huésped de la reivindicación 9, el polipéptido de la reivindicación 10 o 12 o producido por el procedimiento de la reivindicación 11 en investigación biomédica o detección selectiva de fármacos in vitro.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8A

Figura 8B

Figura 10

Figura 11