Procedimiento de detección de rotura de membranas fetales.

Procedimiento de detección in vitro de una rotura de membranas fetales,

que comprende una etapa de búsqueda simultánea, en una muestra de secreciones vaginales o de cuello uterino, de la alfa-fetoproteína (AFP) y de la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGFBP-1), procedimiento en el que se detecta una rotura de membrana fetal cuando se detecta solo la IGFBP-1 o en combinación con la AFP, la ausencia de rotura se detecta cuando no se detecta ni la IGFBP-1 ni la AFP, y cuando solo se detecta la AFP, el procedimiento comprende opcionalmente además una etapa de detección de la IGFBP-1 sola.

Procedimiento de detección de rotura de membranas fetales

Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento de detección de rotura de membranas fetales y al uso de un dispositivo de implementación de dicho procedimiento.

La presente invención encuentra una aplicación, en particular, en el campo médico, el campo del diagnóstico, en particular en el campo de la obstetricia.

En la siguiente descripción, las referencias entre corchetes ([ ]) se refieren a la lista de referencias presentadas al final del texto.

Estado de la técnica Durante el embarazo, las mujeres pueden estar sometidas a diferentes factores y/o sucesos que podrían poner en peligro el embarazo. La rotura de membranas fetales forma parte de estos sucesos, en particular cuando la rotura de membranas es prematura.

El origen de esta rotura es variable. Puede tratarse, por ejemplo, de un traumatismo directo o indirecto, como un golpe a nivel abdominal, accidente de circulación, relaciones sexuales, etc. Puede deberse también a una fragilidad endógena de la membrana (deficiencia de colágeno, malnutrición, tabaquismo) , un embarazo de gemelos, hidramnios, una complicación asociada con una amnioscopia, a la colocación de una laminaria durante una interrupción voluntaria del embarazo (IVE) . También puede tener origen infeccioso y ser debida a una corioamnionitis, vulvovaginitis o endometritis. Finalmente, en el 60% de los casos la causa de la rotura es desconocida.

La rotura de membranas fetales conlleva un flujo del líquido amniótico y representa una “puerta abierta” a todos los agentes patógenos: bacterias, virus etc. Estos agentes pueden infectar, por ejemplo, el contenido uterino, el feto.

Además, la pérdida del líquido amniótico conlleva una disminución del espacio disponible para el desarrollo del feto. Cuando la rotura tiene lugar antes del plazo de 24 semanas de amenorrea, esta disminución puede poner en peligro el pronóstico vital del feto produciendo un aborto y/o conduciendo al nacimiento de un bebé no viable. Después de este plazo de 24 semanas, el pronóstico vital del niño todavía está en cuestión dando lugar a un parto prematuro y/o una infección del feto que puede conducir a la inducción voluntaria del parto. Además, la disminución del volumen del líquido amniótico puede provocar problemas de malformación, atrofia de las extremidades, anomalía del desarrollo de diferentes partes del cuerpo.

El diagnóstico de la rotura de membranas fetales es esencialmente clínico. Se trata de un examen con espéculo por el cual se ve un flujo del líquido amniótico. Esta prueba de diagnóstico es una prueba poco sensible, poco adaptada al diagnóstico de microrroturas y que no permite detectar rápida y fácilmente la rotura de membranas y que está asociado sobre todo a la capacidad del médico para poder identificar/ver el flujo del líquido.

Existen también otras pruebas, por ejemplo, la prueba de la nitrazina o la prueba de la diamina oxidasa, que permiten detectar una rotura de membranas fetales.

Sin embargo, estas pruebas no son fiables y pueden conllevar a la obtención de resultados falsos negativos (las pacientes para las que el resultado es un falso negativo presentan, por lo tanto, un embarazo de riesgo y no se las atiende y/o trata) y falsos positivos (las pacientes para las que el resultado es falso positivo no presentan embarazo de riesgo y pueden ser atendidas de la misma forma que una mujer con rotura, con el riesgo en particular de inducir un parto inútil) . La prueba de la nitrazina, indicador de pH, está sometida a numerosas interferencias, en particular de la sangre, esperma, antisépticos o infecciones vaginales. La prueba de la diamina oxidasa recurre a técnicas de demostración basadas en radioinmunología y, por lo tanto, poco prácticas. Su sensibilidad varía de 84 a 91%. Su especificidad está limitada por la interferencia de la sangre.

También se han desarrollado y comercializado pruebas de diagnóstico basadas en la detección de la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (inulin-like growth factor-binding proteina 1: IGFBP1) por anticuerpos específicos en una muestra vaginal o de cuello uterino. Esta proteína está presente en el líquido amniótico en una concentración de 100 a 1000 veces superior a la del suero materno (Rutanen et al., “Radioimmunoassy of placental protein 12: levels in amniotic fluid, cord blood and serum of healthy adults, pregnant women and patients with trophoblastic disease”. Am. J. Obstet. Gynecol. 1982. [1]) . Ejemplos de pruebas de la técnica anterior que usan este marcador son, por ejemplo, las pruebas inmunológicas descritas en la patente europea EP 0565541. Sin embargo, estas pruebas no son fiables puesto que pueden dar resultados falsos negativos que se deben, por ejemplo, a una concentración pequeña de IGFBP1 en el líquido amniótico, a un efecto gancho, a una degradación de la proteína en la vagina y/o in vitro, o a un efecto de la matriz. También pueden generar resultados falsos positivos que se deben, por ejemplo, a la presencia residual de IGFBP1 procedente de otros medios biológicos distintos del líquido amniótico, en particular la sangre o las células deciduales del cuello uterino cuando está maduro.

También se han descrito pruebas de diagnóstico basadas en la detección de la alfa-fetoproteína (AFP) por anticuerpos específicos en una muestra vaginal o de cuello uterino. Un ejemplo de prueba de la técnica anterior que usa este marcador se describe en el artículo de Rochelson (Rochelson et al., “Rapid assay: possible application in the diagnosis of premature rupture of the membranes”. Obstet. Gynecol. 1983; 62: 414-418 [2]) .

Sin embargo, esta prueba no es fiable puesto que puede dar resultados falsos negativos y falsos positivos (sensibilidad de 93% y especificidad de 94% en mujeres con menos de 39 semanas de amenorrea) .

Otro ejemplo de prueba de la técnica anterior la ha descrito Kishida (Kishida et al. “Diagnosis of premature rupture of the membranes in preterm patients, using an improved AFP kit : comparison with ROM-Check and/or nitrazine test”. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology 69 (1996) 77-82) [12]. Para una población de pacientes cuyo término está comprendido entre 16 y 36 semanas, la sensibilidad y la especificidad en la muestra vaginal eran respectivamente 96, 9% y 92, 9%. En una muestra de cuello uterino, la sensibilidad y la especificidad eran respectivamente de 100% y 85, 7%. Por lo tanto, y como otras pruebas del estado de la técnica, esta prueba no es fiable puesto que proporciona resultados falsos negativos y falsos positivos.

Se han descrito también otros marcadores de roturas menos eficaces, como la hormona coriogonadotropina humana (hCG) (Young-Han Kim et al., “Vaginal fluid b-human chorionic gonadotropin level in the diagnosis of premature rupture of membranes”. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2005: 84: 802-805 [3]) o la prolactina (PRL) (Koninckx PR et al., “Prolactin concentration in vaginal fluid: a new method for diagnosing ruptured membranes”. Br. J. Obstet. Gynaecol. 1981; 88:607-610 [4]) .

El documento US 2006/0240495 describe la detección en una muestra vaginal de varios marcadores seleccionados de, entre otros, AFP, fibronectina fetal, IGFBP-1, prolactina y hormona lactogénica placentaria humana, para indicar el estado del entorno intraamniótico (rotura de membranas fetales, infección o inflamación intraamniótica, maduración pulmonar fetal) . La combinación de la AFP y la IGFBP-1 para detectar una rotura de membranas fetales no se describe explícitamente.

Por lo tanto, existe una necesidad real de encontrar un procedimiento de detección de la rotura de las membranas fetales que corrija estos defectos, inconvenientes y obstáculos de la técnica anterior, en particular, un procedimiento con una mejor sensibilidad y/o una mejor especificidad, que permita reducir los costes y mejorar la detección de la rotura de membranas fetales.

Descripción de la invención La presente invención tiene precisamente por objeto responder a estas necesidades e inconvenientes de la técnica anterior proporcionando un procedimiento de detección in vitro de rotura de membranas fetales.

En particular, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de detección in vitro de una rotura de membranas fetales, que comprende una etapa de búsqueda simultánea en una muestra vaginal o de cuello uterino, de la alfa-fetoproteína (AFP) y de la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFBP-1) , procedimiento en el que se detecta una rotura de membrana fetal cuando... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección in vitro de una rotura de membranas fetales, que comprende una etapa de búsqueda simultánea, en una muestra de secreciones vaginales o de cuello uterino, de la alfa-fetoproteína (AFP) y de la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGFBP-1) , procedimiento en el que se detecta una rotura de membrana fetal cuando se detecta solo la IGFBP-1 o en combinación con la AFP, la ausencia de rotura se detecta cuando no se detecta ni la IGFBP-1 ni la AFP, y cuando solo se detecta la AFP, el procedimiento comprende opcionalmente además una etapa de detección de la IGFBP-1 sola.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la búsqueda se realiza con al menos un anticuerpo de captura dirigido contra la AFP y con al menos un anticuerpo de captura dirigido contra la IGFBP-1.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la búsqueda se realiza a partir de una muestra de secreciones vaginales o de cuello uterino diluida en una solución tampón.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el procedimiento comprende el ajuste de al menos uno de los parámetros seleccionados del volumen, pH, fuerza iónica del medio tampón, siendo dicho ajuste común para la AFP y la IGFBP-1.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 3 o 4, en el que el pH de la solución tampón es de 5 a 10.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que los anticuerpos de captura anti-AFP y anti-IGFBP-1 están todos en forma seca.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha etapa de búsqueda comprende una etapa de revelado realizada con al menos un anticuerpo marcado anti-AFP y al menos un anticuerpo marcado anti-IGFBP-1.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el procedimiento comprende el ajuste de al menos uno de los parámetros seleccionados de la concentración de los anticuerpos de captura y/o la concentración de los anticuerpos marcados, siendo dicho ajuste específico para la AFP y la IGFBP-1.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha IGFBP-1 se detecta a partir de una concentración de 1 a 10 ng/ml.

10. Uso del dispositivo que comprende:

a. una zona (1) de depósito de una muestra

b. una zona (2) que comprende anticuerpos anti-IGFBP-1 y anticuerpos anti-AFP marcados

c. una zona (3) de revelado que comprende anticuerpos de captura dirigidos contra la AFP y anticuerpos de captura dirigidos contra la IGFBP-1

para llevar a cabo el procedimiento de la invención según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Uso del dispositivo según la reivindicación 10, en el que la zona de depósito (1) es o un papel absorbente o un soporte de fibra de vidrio.

12. Uso del dispositivo según la reivindicación 10 u 11, en el que la zona de revelado (3) es una membrana de nitrocelulosa.

13. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la zona (2) es un soporte de fibra de vidrio.