Cultivo in vitro de una especie de Helicobacter.

Procedimiento para el aislamiento de una especie de Helicobacter a partir de una muestra,

que comprende las etapas de cultivar dicha muestra, que comprende dicha especie de Helicobacter, en un sistema de cultivo, en donde dicho sistema comprende un medio de cultivo que tiene un pH entre 5,0 y 6,0, y cuyo medio está complementado con suero a al menos el 10% o con sangre a al menos el 7,5%.

Cultivo in vitro de una especie de Helicobacter Campo de la invención La presente invención se refiere a los procedimientos y herramientas para el aislamiento y/o el cultivo in vitro de una 5 especie de Helicobacter, más en concreto Candidatus Helicobacter suis. La invención se refiere además a la preparación de antígenos y vacunas de los cultivos de aislados de una especie de Helicobacter.

Antecedentes

Las infecciones de Helicobacter pylori en los humanos son una importante causa de úlcera gástrica y duodenal, así como de cáncer de estómago. La bacteria H. pylori no es la única especie de Helicobacter capaz de colonizar la 10 mucosa gástrica humana. Helicobacter heilmannii (denominación propuesta) se ha encontrado en aproximadamente el 0, 96% de las biopsias gástricas de los humanos (Heilmann y Borchard (1991) Gut 32, 137-140) . Este microorganismo está estrechamente asociado a la gastritis, pero también está asociado a la úlcera péptica, el adenocarcinoma gástrico y al linfoma del tejido linfocítico asociado a la mucosa. Los resultados más recientes indican que H. heilmannii no es una única especie, sino que representa diferentes especies bacterianas con un 15 aspecto helicoidal similar, la mayoría de las cuales tienen probablemente un origen zoonótico. La clasificación en H. heilmannii de tipo 1 y H. heilmannii de tipo 2 se estableció sobre la base de la secuencia de los genes del ARNr 16S (Solnick et al. (1993) J. Infect. Dis. 168, 379-385) . Más del 50% de las infecciones de H. heilmannii en los humanos se deben a H. heilmannii de tipo 1 (Trebesius et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39, 1510-1516) . Se ha demostrado que H. heilmannii de tipo 1 es idéntico a Candidatus H. suis (O'Rourke et al. (2004) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 2203

2211) , una bacteria helicoidal hasta ahora incultivable que coloniza el estómago de más del 60% de los cochinos para matadero. La función real de Candidatus H. suis en la enfermedad gástrica de los cerdos es todavía un tema controvertido, pero se ha sugerido que esta bacteria está asociada a la úlcera gástrica del lado esofágico y con la gastritis pilórica crónica. La inoculación de esta bacteria en ratones se ha utilizado para aislarla de la mucosa del estómago del cerdo infectado (Dick et al. (1989) J. Med. Microbiol. 29, 55-62) . En Hellemans et al. [ (2005)

Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4530-4535] se modificó el modelo in vivo de ratón existente para la infección de Candidatus H. suis, con el objeto de evaluar la sensibilidad a los antibióticos que tiene este microorganismo. El cultivo in vitro de Candidatus H. suis no se ha conseguido todavía.

En la patente de los EE.UU. nº US2001055787 se describe un medio de agar para el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, que comprende el suero animal a una concentración de entre aproximadamente el 8% y el 12% del 30 volumen final del medio de agar, en donde dicho medio se encuentra a un pH de entre aproximadamente 6, 0 y aproximadamente 6, 25.

En Pickering et al. (1989) Infect. Immunol. 57, 1235-239 se describe el cultivo de Ureaplasma urealyticum en un agar a pH 5, 5, que comprende suero de caballo al 20 %.

En Hellemans et al. (2006) Vaccine 24 (14) , 2469-2476 se hace referencia a los procedimientos de inmunización 35 cruzada contra Helicobacter, en donde los homogeneizados de estómago que comprenden Candidatus Helicobacter suis se utilizan para infectar animales.

Compendio de la invención La presente invención se basa en el desarrollo de sistemas de cultivo que permiten el aislamiento y el cultivo de una especie de Helicobacter, más en concreto de Candidatus Helicobacter suis, que previamente no se había 40 demostrado que se pudiera mantener como un aislado in vitro.

Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de un recipiente del cultivo que comprende un medio de cultivo sólido, que comprende sangre entre el 7, 5% y el 15% o suero entre el 12, 5 y el 25%, en donde el medio sólido está ajustado a un pH entre 5, 0 y el 5, 5 para el aislamiento y/o cultivo de una especie de Helicobacter.

En una realización específica, el componente sólido comprende nutrientes para el crecimiento del microorganismo 45 de cultivo exigente. Más en particular, estos nutrientes se seleccionan del grupo de medio para Brucella, medio de Mueller-Hinton o el medio de infusión cerebro-corazón.

En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer procedimientos para el aislamiento de una especie de Helicobacter, más en concreto Candidatus Helicobacter suis, de una muestra que comprende la misma especie de Helicobacter, en donde dichos procedimientos comprenden las etapas de cultivar la muestra que comprende la 50 especie de Helicobacter en un sistema de cultivo que comprende un medio de cultivo que tiene un pH entre 5, 0 y 6, 0, que se complementa con suero a al menos el 10% o sangre a al menos el 7, 0%.

crecimiento de la bacteria de cultivo exigente. Más específicamente, los nutrientes para el crecimiento de la bacteria de cultivo exigente se seleccionan del grupo que consiste en nutrientes para Brucella, de Mueller-Hinton o de infusión cerebro-corazón. Adicionalmente o de manera alternativa, en realizaciones específicas, el medio de cultivo comprende al menos una sustancia selectiva que inhibe el crecimiento de hongos y/o microorganismos grampositivos y/o gramnegativos diferentes a la especie de Helicobacter a cultivar. En otras realizaciones específicas, la al menos una sustancia selectiva se selecciona del grupo que consiste en: vancomicina, lactato de trimetoprima, polimixina B, cefsulodina, colistina, amfotericina B, violeta de genciana, nistatina y nisina.

En realizaciones específicas de los procedimientos de la presente invención descritos en la presente memoria, el medio de cultivo que comprende suero a al menos el 10% comprende suero entre el 12, 5 y el 25 %. Otra alternativa es que el medio de cultivo que comprende sangre a al menos el 7, 0% comprenda sangre entre el 7, 5 y el 15%, más en particular entre el 10 y el 15%.

Optativamente, el medio de cultivo utilizado en los procedimientos de la presente invención comprende además uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo de vitamina B12, L-glutamina, adenina, guanina, ácido paminobenzoico, L-cistina, NAD (coenzima 1) , cocarboxilasa, nitrato férrico, tiamina e hidrocloruro de cisteína.

En una realización específica de los procedimientos de la invención descritos en la presente memoria, se utiliza un sistema de cultivo que comprende un componente sólido y uno líquido, en donde al menos el componente sólido comprende el medio de cultivo que se describe más arriba. En otras realizaciones, el componente sólido y/o el componente líquido comprende nutrientes para el crecimiento de la bacteria de cultivo exigente. Más específicamente, estos nutrientes se seleccionan del grupo que consiste en nutrientes para Brucella, de Mueller

Hinton o de infusión cerebro-corazón.

En otra realización específica de los procedimientos de la invención, el componente sólido y/o líquido de los sistemas de cultivo comprende al menos una sustancia selectiva que inhibe el crecimiento de hongos y/o microorganismos grampositivos y/o gramnegativos diferentes a la especie de Helicobacter a cultivar. Más en particular, la al menos una sustancia selectiva se selecciona del grupo que consiste en: vancomicina, lactato de trimetoprima, polimixina B, cefsulodina, colistina, amfotericina B, violeta de genciana, nistatina y nisina.

Otras realizaciones específicas de los procedimientos de la invención utilizan sistemas de cultivo que comprenden un componente sólido y uno líquido, en donde el componente sólido comprende suero entre el 12, 5 y el 25% o sangre entre el 7, 5 y el 15%, más particularmente entre el 10 y el 15%.

Otras realizaciones específicas de los procedimientos de la invención utilizan sistemas de cultivo que comprenden un componente sólido y uno líquido como se describe más arriba, en donde el componente sólido y/o líquido comprende además uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo de vitamina B12, L-glutamina, adenina, guanina, ácido p-aminobenzoico, L-cistina, NAD (coenzima 1) , cocarboxilasa, nitrato férrico, tiamina e hidrocloruro de cisteína.

Los procedimientos de la presente invención son particularmente adecuados para el aislamiento de Candidatus Helicobacter suis. De hecho, la presente invención da a conocer, por primera vez, un procedimiento para obtener un aislado de Candidatus Helicobacter suis libre de los hongos o de las bacterias presentes en el estómago.

En consecuencia, un segundo aspecto de la presente invención da a conocer aislados de Candidatus Helicobacter... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento de una especie de Helicobacter a partir de una muestra, que comprende las etapas de cultivar dicha muestra, que comprende dicha especie de Helicobacter, en un sistema de cultivo, en donde dicho sistema comprende un medio de cultivo que tiene un pH entre 5, 0 y 6, 0, y cuyo medio está

complementado con suero a al menos el 10% o con sangre a al menos el 7, 5%.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho medio de cultivo comprende nutrientes para el crecimiento de bacterias de cultivo exigente.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichos nutrientes para el crecimiento de las

bacterias de cultivo exigente se seleccionan del grupo que consiste en nutrientes para Brucella, de Mueller-Hinton o 10 de infusión cerebro-corazón.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho medio de cultivo comprende al menos una sustancia selectiva que inhibe el crecimiento de los hongos y/o microorganismos grampositivos y/o gramnegativos que no sean la especie de Helicobacter a cultivar.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha al menos una sustancia selectiva se

selecciona del grupo que consiste en: vancomicina, lactato de trimetoprima, polimixina B, cefsulodina, colistina, amfotericina B, violeta de genciana, nistatina y nisina.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho medio de cultivo comprende uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste en vitamina B12, L-glutamina, adenina, guanina, ácido p-aminobenzoico, L-cistina, NAD (coenzima 1) , cocarboxilasa, nitrato férrico, tiamina e hidrocloruro de cisteína.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha especie de Helicobacter es Helicobacter suis.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia del gen del ARNr 16S de dicha especie de Helicobacter tiene al menos una identidad de secuencia del 99% con la secuencia del gen del ARNr 16S con el número de acceso de GenBank AF127028 de 17 de noviembre de 1999 descrita en la SEQ ID nº 7 y en la figura 1.

9. Aislado de Helicobacter suis, en donde la secuencia del gen del ARNr 16S de Helicobacter suis tiene una identidad de secuencia de al menos el 99% con la secuencia del gen del ARNr 16S con el número de acceso de GenBank AF127028 de 17 de noviembre de 1999 descrita en la SEQ ID nº 7 y en la figura 1, libre de las bacterias u hongos presentes en el estómago, que se puede obtener mediante los procedimientos de acuerdo con cualquiera de

las reivindicaciones 1 a 8.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende la etapa de dar pases a una especie de Helicobacter como la aislada mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la etapa de aplicar dicha especie de Helicobacter aislada en un sistema de cultivo, en donde dicho sistema comprende un medio de cultivo que tiene un pH entre 4, 0 y 7, 0, en donde dicho medio está complementado con suero a al menos el 10% o con sangre a al menos el 7, 5%, y la incubación en éste de la especie de Helicobacter aislada.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha especie de Helicobacter es Helicobacter suis.

12. Utilización de un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo sólido, en donde el medio sólido

comprende sangre en una concentración entre el 7, 5% y el 15% o que comprende suero en una concentración entre el 12, 5% y el 25%, en donde el pH de dicho medio sólido se encuentra entre 5, 0 y 5, 5, para el aislamiento y/o el cultivo de una especie de Helicobacter.

13. Vacuna que comprende una preparación de antígenos de un aislado de Helicobacter suis, en donde la preparación de antígenos se selecciona del grupo que consiste en:

ï?­ï?  bacterias enteras muertas de Helicobacter suis, ï?­ï?  bacterias debilitadas de Helicobacter suis atenuadas vivas, y ï?­ï?  un lisado de bacterias enteras muertas de Helicobacter suis inactivas o de bacterias debilitadas de Helicobacter suis atenuadas vivas, ï?­ï?  la fracción soluble de un cultivo bacteriano de Helicobacter suis tratado con ultrasonidos, y 23

ï?­ï?  una proteína de Helicobacter suis seleccionada del grupo que consiste en una proteína de choque térmico, una proteína de la ureasa, cagA y vacA, en donde dicho Helicobacter suis tiene una secuencia del gen del ARNr 16S que es idéntica al menos al 99% a la secuencia del gen del ARNr 16S con el número de acceso de GenBank AF127028 de 17 de noviembre de 1999 5 descrita en la SEQ ID nº 7 y en la figura 1.

14. Procedimiento para producir una preparación de antígenos de Helicobacter suis, en donde dicho procedimiento comprende las etapas de:

aislar Helicobacter suis de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de las reivindicaciones 10 u 11, y producir una preparación de antígenos a partir del aislado de Helicobacter suis obtenido.

15. Utilización de uno o más de: ï?­ï?  un lisado de un aislado de Helicobacter suis, ï?­ï?  la fracción soluble de un cultivo bacteriano de Helicobacter suis tratado con ultrasonidos, ï?­ï?  una proteína de Helicobacter suis seleccionada del grupo que consiste en una proteína de choque térmico, una proteína de la ureasa, cagA y vacA, ï?­ï?  un aislado de Helicobacter suis atenuado vivo, y ï?­ï?  un aislado de Helicobacter suis entero muerto, para la fabricación de una vacuna contra una infección por Helicobacter suis, en donde dicho Helicobacter suis tiene una secuencia del gen del ARNr 16S que es idéntica al menos al 99% a la 20 secuencia del gen del ARNr 16S con el número de acceso de GenBank AF127028 de 17 de noviembre de 1999 descrita en la SEQ ID nº 7 y en la figura 1.

** (Ver fórmula) **