ADYUVANTES DE ACIDOS NUCLEICOS.

Una composición adyuvante que comprende: (i) una primera secuencia de ácido nucleico;

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico; y (iii) vehículos nucleares, en la que: (a) dicha primera secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad A truncada obtenida o derivada de una exotosina de ribosilación de ADP bacteriana; (b) dicha segunda secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad B truncada obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana; (c) dichas secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda recubren los vehículos nucleares y están ligadas operablemente, o cada una está ligada operablemente a un promotor activo en una célula de mamífero; y (d) cada una de dichas regiones codificantes de las subunidades truncadas tiene una deleción en 5'', codifica un péptido de una subunidad que no tiene un péptido de señalización bacteriana en el extremo amino y está ligada operablemente a una secuencia directora para su secreción desde una célula de mamífero

Adyuvantes de ácidos nucleicos.

Campo técnico

La invención se refiere a los campos de la biología molecular y la inmunología, y de forma general se refiere a técnicas de inmunización con ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a polinucleótidos que codifican un adyuvante, y a estrategias de inmunización que emplean dichos polinucleótidos.

Antecedentes

Las técnicas para la inyección de ADN y ARNm en el tejido mamífero con fines de inmunización contra un producto de expresión han sido descritas en la técnica. Se ha demostrado que las técnicas, denominadas "inmunización con ácidos nucleicos" en el presente documento, provocan respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células. Por ejemplo, se demostró que el suero de los ratones inmunizados con una construcción de ADN que codificaba la glucoproteína de la cubierta, gp160, reaccionaba con gp160 recombinante en inmunoensayos, y se demostró que los linfocitos de los ratones inyectados proliferaban en respuesta a gp120 recombinante. Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156-4160. De forma similar, los ratones inmunizados con un gen de la hormona del crecimiento humana (hGH) demostraron una respuesta inmunitaria basada en anticuerpos. Tang et al. (1992) Nature 356: 152-154. Se ha demostrado que la inyección intramuscular de ADN que codifica una nucleoproteína de influenza dirigida por un promotor mamífero provoca una respuesta de CTL CD8+ que puede proteger a los ratones contra una posterior exposición letal al virus. Ulmer et al. (1993) Science 259: 1745-1749. Los estudios inmunohistioquímicos del sitio de inyección revelaron que el ADN era captado por los mieloblastos, y pudo demostrarse la producción citoplasmática de proteína vírica durante al menos 6 meses. El documento US 5.980.898 se refiere a la inmunización transcutánea.

Sumario de la invención

Es un objetivo primario de la invención proporcionar una composición adyuvante con polinucleótidos como se define en las reivindicaciones anexas.

La secuencias primera y segunda de ácidos nucleicos pueden estar presentes en la misma o en diferentes construcciones de ácidos nucleicos. Las regiones que codifican las subunidades truncadas pueden obtenerse o derivarse de la misma exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana y, en ciertas realizaciones preferidas, la exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana es una toxina del cólera (CT) o una enterotoxina termolábil de E. coli (LT). Además, al menos una de las regiones codificantes de las subunidades truncadas puede modificarse genéticamente para eliminar la toxicidad del péptido de la subunidad codificado por ella, por ejemplo en la que la región codificante de la subunidad A truncada ha sido modificada genéticamente para alterar o inactivar la actividad de ADP-ribosil transferasa en el producto de expresión del péptido de la subunidad.

También es un objetivo primario de la invención proporcionar una composición adyuvante con polinucleótidos que contiene unas secuencias primera y segunda de ácidos nucleicos, en las que la primera secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad A modificada obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana, y la segunda secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad B obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana. La región codificante de la subunidad A modificada y dicha región codificante de la subunidad B codifican cada una un péptido de las subunidades maduras, y la región codificante de la subunidad A modificada ha sido modificada genéticamente para eliminar un motivo KDEL o RDEL del extremo C del péptido de la subunidad codificado por ella.

Como anteriormente, la secuencias primera y segunda de ácidos nucleicos pueden estar presentes en la misma o en diferentes construcciones de ácidos nucleicos. Las regiones que codifican las subunidades truncadas pueden obtenerse o derivarse de la misma exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana y, en ciertas realizaciones preferidas, la exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana es una toxina del cólera (CT) o una enterotoxina termolábil de E. coli (LT). Además, al menos una de las regiones codificantes de las subunidades truncadas puede estar modificada genéticamente para eliminar la toxicidad del péptido de la subunidad codificada por ella. Por ejemplo en la que la región codificante de la subunidad A truncada ha sido modificada genéticamente para alterar o inactivar la actividad de ADP-ribosil transferasa en el producto de expresión de los péptidos de las subunidades.

En ciertos aspectos de la invención, las composiciones anteriores pueden proporcionarse en forma de partículas, por ejemplo en las que las composiciones son partículas adecuadas para la administración con un dispositivo de administración de partículas. A este respecto, las presentes composiciones pueden recubrirse sobre la misma partícula transportadora nuclear o sobre una diferente y así ser adecuada para la administración usando una técnica de transfección mediada por partículas. Las partículas transportadoras nucleares tendrán un diámetro medio de aproximadamente 0,1 a 10 µm, y pueden comprender un metal como por ejemplo oro. Por consiguiente, todavía otro objetivo más de la invención es proporcionar un dispositivo de administración de partículas cargado (por ejemplo, que contenga) una composición con partículas tal como se define en el presente documento.

También es un objetivo principal de la invención proporcionar el uso de una composición que contenga una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico, donde cada secuencia incluye una región codificante para una subunidad de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana en la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado contra un antígeno de interés en dicho sujeto. El antígeno de interés y la composición se administran al sujeto de tal forma que las subunidades de la toxina codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda se expresen en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria mejorada contra el antígeno. La primera secuencia de ácido nucleico contiene una región codificante de la subunidad A truncada obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana, y la segunda secuencia de ácido nucleico contiene una región codificante de la subunidad B truncada obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana, sin embargo con la condición de que cada una de las regiones codificantes de las subunidades truncadas tiene una deleción en 5' y codifica un péptido de la subunidad que no tiene un péptido de señalización bacteriana en el extremo amino.

Un objetivo primario relacionado de la invención es proporcionar un procedimiento para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno de interés en un sujeto. El procedimiento de forma general supone: (a) administrar el antígeno de interés al sujeto; (b) proporcionar una composición adyuvante que comprende secuencias primera y segunda de ácidos nucleicos, en la que la primera secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad A truncada obtenida o derivada de una exotosina de ribosilación de ADP bacteriana, y la segunda secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad B truncada obtenida o derivada de una exotosina de ribosilación de ADP bacteriana; y (c) administrar la composición adyuvante al sujeto, por lo cual al introducirlas en el sujeto, las secuencias primera y segunda de ácidos nucleicos son expresadas para proporcionar péptidos de las subunidades en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria mejorada contra el antígeno de interés. Las regiones codificantes de las subunidades están truncadas porque cada región codificante tiene una deleción en 5' y codifica un péptido de la subunidad que no tiene un péptido de señalización bacteriana en el extremo amino.

Además es otro objetivo principal de la invención proporcionar el uso de una composición que comprenda una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico, donde cada secuencia incluye una región codificante para una subunidad de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana en la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado contra un antígeno de interés en dicho sujeto. El antígeno de interés y la composición se administran al sujeto de tal forma que las subunidades de la toxina codificadas...

1. Una composición adyuvante que comprende: (i) una primera secuencia de ácido nucleico; (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico; y (iii) vehículos nucleares, en la que: (a) dicha primera secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad A truncada obtenida o derivada de una exotosina de ribosilación de ADP bacteriana; (b) dicha segunda secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad B truncada obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana; (c) dichas secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda recubren los vehículos nucleares y están ligadas operablemente, o cada una está ligada operablemente a un promotor activo en una célula de mamífero; y (d) cada una de dichas regiones codificantes de las subunidades truncadas tiene una deleción en 5', codifica un péptido de una subunidad que no tiene un péptido de señalización bacteriana en el extremo amino y está ligada operablemente a una secuencia directora para su secreción desde una célula de mamífero.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la región codificante de la subunidad A truncada ha sido modificada genéticamente además para eliminar un motivo KDEL o RDEL del extremo C del péptido de la subunidad codificado por ella.

3. Una composición adyuvante que comprende: (i) una primera secuencia de ácido nucleico; (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico; y (iii) vehículos nucleares, en la que: (a) dicha primera secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad A modificada obtenida o derivada de una exotosina de ribosilación de ADP bacteriana; (b) dicha segunda secuencia de ácido nucleico es una región codificante de la subunidad B obtenida o derivada de una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana; (c) dichas secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda recubren los vehículos nucleares y están ligadas operablemente, o cada una está ligada operablemente a un promotor activo en una célula de mamífero; y (d) cada una de dicha región codificante de la subunidad A modificada modificada y dicha región codificante de la subunidad B codifican cada una un péptido de la subunidad maduro, y con la condición adicional de que la región codificante de la subunidad A modificada ha sido modificada genéticamente de forma que se elimine un motivo KDEL o RDEL del extremo C en el péptido de la subunidad codificado por ella y está ligada operablemente a una secuencia directora para la secreción desde una célula de mamífero.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la región codificante de la subunidad A modificada y la región codificante de la subunidad B han sido truncadas cada una mediante una deleción en 5' por la cual cada una de dichas regiones codificantes de las subunidades truncadas codifica un péptido de una subunidad que no tiene un péptido de señalización bacteriana en el extremo amino.

5. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la exotoxina de ribosilación de ADP bacteriana es una enterotoxina termolábil (LT) de E. coli.

6. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende un antígeno de interés.

7. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de interés.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la que el antígeno es de un patógeno bacteriano, un patógeno vírico, un patógeno parasitario, un alérgeno o un antígeno específico de tumor.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el antígeno es de un influenzavirus, un virus Herpes símplex (HSV), virus de la hepatitis, o papillomavirus.

10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la composición con partículas es adecuada para la administración transdérmica mediante un dispositivo de administración de partículas.

12. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la partícula transportadora nuclear tiene un diámetro medio de 0,1 a 10 µm.

13. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la partícula transportadora nuclear comprende un metal.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el metal es oro.

15. Una composición adyuvante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado contra un antígeno de interés mediante la administración del antígeno de interés y la composición al sujeto.

16. Una composición adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el antígeno de interés y la composición se administran en el mismo sitio del sujeto.

17. Una composición adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en la que el antígeno de interés y la composición se administran al mismo tiempo.

18. Una composición adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la composición además comprende el antígeno de interés.

19. Una composición adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la composición comprende una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de interés.

20. Una composición adyuvante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en la que el antígeno de interés es de un patógeno bacteriano, un patógeno vírico, un patógeno parasitario, un alérgeno o un antígeno específico de tumor.

21. Una composición adyuvante de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el antígeno es un influenzavirus, un virus Herpes símplex (HSV), virus de la hepatitis, o papillomavirus.

22. Una composición adyuvante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que las partículas transportadoras nucleares se administran al sujeto usando una técnica de administración mediada por partículas.

23. Una composición adyuvante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en la que el sujeto es un ser humano.

24. Productos que contienen una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un antígeno de interés en forma de una preparación combinada para el uso simultáneo, por separado o secuencial para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado contra dicho antígeno.

25. Un dispositivo de administración de partículas para la administración transdérmica que se carga con una composición con partículas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

26. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 25 que es una jeringuilla sin agujas.

27. Un envase monodosis o multidosis herméticamente sellado adaptado para usar en un dispositivo de administración de partículas, comprendiendo dicho envase una composición adyuvante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

28. Uso de unas secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado contra un antígeno de interés mediante la administración del antígeno de interés y el medicamento al sujeto.