Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo.

Un recombinante de adenovirus oncolítico, en donde dicho recombinante comprende un virus esencial,

un elemento regulador específico de células tumorales en donde el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT selectivo de células tumorales de SEQ. ID NO: 2 y un gen inmunorregulador seleccionado de los genes IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, INF-alfa e INF-beta, siendo dicho virus esencial un adenovirus o una variante de adenovirus genéticamente mejorada seleccionada de:

i) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES);

ii) un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus se ha reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus;

iii) un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT;

iv) un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5 K y 14,7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada; y

v) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo Campo de la Invención La presente invención se refiere a una terapia génica para tumores. Más específicamente, la invención se refiere a adenovirus oncolíticos recombinantes, que se replican preferentemente en células tumorales y expresan factores imunoestimulantes para inducir respuestas inmunes específicas de tumor en el cuerpo humano.

Antecedentes de la Invención Hace más de un siglo desde que se utilizó por primera vez un virus para tratar una enfermedad neoplástica. Algunos médicos observaron que ocasionalmente un paciente se curaba después de una infección por virus. Este rompecabezas no se resolvió hasta el comienzo de los años 1920, y desde entonces ha atraído la atención de los científicos y médicos de clínica. Éste fue el comienzo de la viroterapia (utilización de virus para tratar el cáncer) . Hacia los años 1950, habían sido ensayados más de 50 virus respecto a actividad antitumoral en animales o pacientes (Mullen y Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119; McCormick F (2001) Nature Review Cancer

1:130.141) . En 1956, el doctor Smith y su equipo trataron más de 30 pacientes de cáncer cervical con lisado de células HeLa o células KB que estaban infectadas con 10 serotipos de adenovirus de tipo salvaje por inyección intratumoral, inyección arterial intrahepática o inyección intravenosa. No se observó efecto secundario grave alguno, excepto síntomas de gripe en la mayoría de los pacientes; por el contrario, los tumores de varios pacientes se contrajeron y se volvieron necróticos. Lamentablemente, debido a la limitación de la producción y purificación de los virus, este trabajo no progresó ulteriormente. El trabajo del doctor Smith había estimulado a muchos científicos a explorar la posibilidad de utilizar virus para tratar cánceres (Chiocca EA (2002) Nature-Review Cancer 2:938-950) .

Junto con el proceso realizado en biología molecular e ingeniería genética, en particular, con mejores conocimientos en virus en relación con el ser humano, los científicos han logrado manipular genéticamente el genoma viral desde finales del pasado siglo, lo que incluye el éxito en la creación de mutantes de virus que pueden replicarse 25 específicamente en células tumorales (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-141) . Por ejemplo, el mutante del virus del herpes simple específico de glioma G207 (Martuza et al., (1991) Science 252:854-856) , el adenovirus Add11520 (Onyx-015) , un mutante de adenovirus que se replica preferentemente en células tumorales deficientes en p53 (Bischoff et al., (1996) Science 274:373-376) y CV706, un mutante de adenovirus específico de las células de cáncer de próstata (Rodriguez et al. (1997) Cancer Research 57: 2559-2563) . Este trabajo ha sentado las bases para la formación de un nuevo campo: La Viroterapia del Cáncer. En la actualidad, existen más de 20 variantes de virus en pruebas clínicas (Mullen y Tanabe (20002) The Oncologist 7:106-119) .

Existen varios enfoques para la producción de virus oncolíticos específicos de células tumorales. Un enfoque para producir una variante de virus que se replica selectivamente en células tumorales consiste en la utilización de elementos reguladores específicos de células tumorales tales como promotores e intensificadores que controlan la 35 expresión de genes virales esenciales, por ejemplo, los genes E1A, E1B, E2 y E4 de adenovirus (DeWeese et al. (2001) Cancer Research 61:7464-7472) . Por este enfoque, genes virales esenciales y en última instancia la replicación de los virus podrían ponerse bajo control de elementos reguladores específicos de células tumorales; tales elementos reguladores incluyen el promotor e intensificadores del antígeno específico de próstata (PSA) , el promotor e intensificadores de la alfa-feto-proteína (AFP) , el promotor de E2F-1 humano, etc. (McCormick F (2001)

Nature Review Cancer 1:130-14) .

La telomerasa en una enzima importante para controlar la longitud del extremo de los cromosomas celulares, capaz de regular la longitud del extremo del cromosoma durante el proceso de la fisión celular. La telomerasa está constituida principalmente por las tres partes, en donde RNA y el gen de la transcriptasa inversa de telomerasa (hTERT) , que tiene actividad catalítica, controlan la actividad de telomerasa, mientras que el promotor hTERT

determinará la expresión y actividad de la telomerasa.

Investigaciones ulteriores han indicado que la telomerasa tiene actividad nula o muy baja en las células normales adultas. (Kim N W et al. Science. 1994 Dec. 23; 266 (5193) :2011-5; Shay J W et al. European Journal of Cancer 1997, 33;271-282) , en tanto que tiene un alto nivel de suministro en más de 90% de las células tumorales (Hahn y Weinberg (2002) Nature Review Cancer 2:331-341; Shay y Wright (1996) Current Opinion Oncology 8:66-71) . Ba

sándose en estas características de hTERT, los científicos han generado con éxito varios vectores en los cuales el promotor hTERT se incorporaba en el genoma viral para suministro de genes, con inclusión de los trabajos publicados recientemente que describen el uso del promotor hTERT para replicación condicional de adenovirus oncolíticos (Lanson et al. (2003) Cancer Research 63:7936-7941; Kawashima et al., (2004) Clinical Cancer Research 10:285-292; Kim et al. (2003) Oncogene 22: 370-380; Irving et al. (2004) Cancer Gene Therapy 174-185) .

Existen un pequeño número de elementos reguladores endógenos en el genoma adenoviral, que regula la expresión de genes virales, por ejemplo, el promotor e intensificador del gen E1A, entre estos elementos reguladores endógenos, la secuencia del intensificador E1A se solapa con la señal de empaquetamiento viral. Con objeto de minimizar el impacto de los elementos reguladores endógenos sobre la regulación de un promotor heterólogo, los científicos han reubicado la señal de empaquetamiento a la rama derecha desde el sitio nativo en el extremo de la izquierda (Bristol et al. (2003) Molecular Therapy 7 (6) :755-764; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63:14901499) . Lamentablemente, esta clase de reubicación de la señal de empaquetamiento viral desde el sitio nativo al extremo de la derecha ha desestabilizado el genoma viral, dando como resultado la generación de muchos mutantes virales (WO 02/067861; ASGT 2003 Annual Meeting, Molecular Therapy) . Por tanto, la reubicación arriba indicada de la señal de empaquetamiento viral no es un enfoque viable para minimizar el impacto de los elementos reguladores endógenos. Cómo minimizar el impacto de los reguladores virales endógenos sobre los elementos heterólogos y prevenir la generación no deseada de muchos mutantes virales, en tanto que se mantiene estable el genoma viral?

Con respecto al nivel de expresión de la telomerasa en humanos, durante el desarrollo y la diferenciación del embrión, los científicos han llegado a reconocer también que existe un determinado nivel de actividad de telomerasa en algunas células que incluyen células del miembro cervical, progenitores, y células madre (Wright et al. (1996) Development Genetics 18:173-179; Sharma et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12343-12346; Kolquist et al. (1996) British Journal of Cancer 80:1156-1161; Tahara et al. (1999) Oncogene 18:1561-1567; Tanaka et al. (1998)

American Journal of Pathology 153:1985-1991) . El bajo nivel de la actividad de expresión de telomerasa ha aconsejado a los científicos cuando los mismos utilizaban el promotor hTERT para suministrar un gen terapéutico en el vector de terapia génica, o para generar adenovirus oncolíticos específicos de células tumorales por control de genes virales esenciales (Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10: 1203-1205) . Debido al bajo nivel de expresión de telomerasa en las células distintas de la diana, tales como los progenitores, los adenovirus oncolíticos controladores del promotor hTERT pueden replicarse masivamente en las células progenitoras, dando como resultado efectos secundarios graves (Huang et al. (2004) Clinical Cancer Research 10:1439-1445; Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10:1203-1205; Masutomi et al. (2003) Cell 114: 241-253) . Por tanto, el aumento de la especificidad de células tumorales del promotor hTERT es uno de los proyectos fundamentales en la generación de adenovirus oncolítico utilizando el promotor hTERT.

Varios documentos consideran la generación y uso de vector de adenovirus oncolítico. Li et al. (Cancer Research, 2001, 61, p. 6428-6436) dan a conocer una variante de adenovirus específico de carcinoma hepatocelular, CV890, que elimina los tumores hepáticos... [Seguir leyendo]

1. Un recombinante de adenovirus oncolítico, en donde dicho recombinante comprende un virus esencial, un elemento regulador específico de células tumorales en donde el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT selectivo de células tumorales de SEQ. ID NO: 2 y un gen inmunorregulador seleccionado de los genes IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, INF-alfa e INF-beta, siendo dicho virus esencial un adenovirus o una variante de adenovirus genéticamente mejorada seleccionada de:

i) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) ;

ii) un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus se ha reemplazado por el 10 botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus;

iii) un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT;

iv) un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10, 4 K, 14, 5 K y 14, 7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada; y

v) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) , y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

2. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el adenovirus se selecciona de los serotipos de adenovirus: 20 Ad2, Ad5, Ad35 y Ad41.

3. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) .

4. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus.

5. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

6. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10, 4 K, 14, 5 K y 14, 7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada.

7. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) , y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y se ha insertado un elemento terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

8. El recombinante de la reivindicación 5, en donde dicho elemento terminal de la transcripción es la secuencia 35 señal temprana poli (A) de SV40.

9. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT, la secuencia codificante para 10, 4 K, 14, 5 K y 14, 7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

10. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

11. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF humano.

12. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho GM-CSF se encuentra en forma fijada a la membrana.

13. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual los genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) , y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

14. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual se ha insertado un elemento terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

15. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual se

ha reemplazado el botón de fibra del serotipo 5 por el botón de fibra del serotipo 35, el elemento regulador específico de las células tumorales es el promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

16. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el gen inmunorregulador es GM-CSF en su forma fijada a la membrana.

17. Un promotor, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 2. 10 18. Una composición farmacéutica, que comprende el recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, formulada para aplicación por inyección.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en donde la composición es para aplicación junto con quimioterapia y radioterapia.

21. El uso del recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la fabricación de un medicamento para prevención y/o tratamiento de tumores.

22. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para prevención y/o tratamiento de tumores.

23. Un método de preparación del recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende los pasos siguientes:

a) generar la rama izquierda de adenovirus que contiene la secuencia promotora hTERT de SEQ ID NO: 2;

b) generar la rama derecha de adenovirus que contiene el gen inmunorregulador; y

c) co-transfectar el DNA plasmídico de la rama derecha y la rama izquierda en células 293, HeLa, HeLa-S3 o A549, y generar el recombinante por recombinación homóloga.

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