Composiciones y métodos para la administración de óxido nítrico.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO que comprende (i) una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX,

y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que cualquiera de

(a) la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 x 10-4 s-1 y 10 s-1 a 37 °C, y la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es de al menos 1 μM a 37 °C, o

(b) la constante de disociación del NO de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de aquella de la hemoglobina alfa humana, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa humana.

Composiciones y métodos para la administración de óxido nítrico

Campo técnico Esta solicitud describe proteínas H-NOX y métodos de uso de las mismas para la administración de óxido nítrico (NO) . Las proteínas H-NOX proporcionan una nueva herramienta terapéutica para la administración de NO a seres humanos, y con fines veterinarios, a animales.

Antecedentes de la invención El NO actúa como un mensajero químico en el control de muchos procesos importantes in vivo, incluyendo la vasodilatación, la neurotransmisión, la inflamación, la agregación de las plaquetas y la regulación del tono del 15 músculo liso gastrointestinal y vascular. Desde el descubrimiento en 1867 por los Drs. Lauder Brunton y William Murrell que la nitroglicerina (GTN) era capaz de tratar afecciones patológicas cardiacas tales como la angina de pecho, los nitratos orgánicos se han usado ampliamente para el tratamiento de casos agudos de vasoconstricción. En las últimas pocas décadas, se ha dilucidado el mecanismo de la vasodilatación. El NO, que es sintetizado en las células endoteliales, difunde hacia las células musculares lisas y activa la ciclasa de guanilato soluble (sGC) para producir GMP cíclico, e inducir así una vasodilatación. El mecanismo clínico de la acción de los nitratos orgánicos se cree por tanto que requiere su biotransformación en NO y la posterior activación de la sGC. Sin embargo, los nitratos orgánicos dejan de ser eficaces en los pacientes después de 24 -48 horas, debido a un fenómeno denominado tolerancia. Por lo tanto, para el tratamiento de los casos crónicos de hipertensión, se usan compuestos tales como los bloqueantes β y los inhibidores de la ECA, aunque éstos también tienen limitaciones y efectos secundarios. Por

lo tanto, los nitrovasodilatadores son los más útiles en el tratamiento de las situaciones agudas en las que se requiere una vasodilatación rápida para aliviar síntomas tales como la angina y el infarto de miocardio. La administración prolongada de nitratos orgánicos da como resultado una reducción en la eficacia, y la vasculatura deja de responder; esta tolerancia impide su uso posterior en casos tanto crónicos como agudos. Por lo tanto, para el tratamiento agudo, se emplea un uso no continuo de un nitrovasodilatador con un efecto limitado. Para los casos crónicos de vasoconstricción, se emplean otras opciones de tratamiento, normalmente mediante el uso de un régimen mixto de nitratos orgánicos y medicaciones para la presión sanguínea independientes del NO, con un éxito parcial.

Dos de las principales teorías competidoras sobre el mecanismo de la tolerancia discurren paralelas entre sí para la explicación del mecanismo de la biotransformación de los nitratos que da lugar a la liberación de NO. Debido a que se cree que el NO es un mediador en los efectos vasodilatadores de los nitratos orgánicos, el mecanismo de liberación del NO desde los nitratos orgánicos puede resultar inhibido, dando como resultado una tolerancia. Pero no se ha comprendido como liberan NO los nitratos orgánicos metabólicamente en los tejidos. Adicionalmente, la teoría basada en el mecanismo para la tolerancia es problemática ya que la tolerancia también reduce la eficacia del NO endógeno y del NO gaseoso exógeno en la mediación de la vasodilatación. Por lo tanto, parece que el mecanismo de biotransformación de los nitratos orgánicos es independiente de la razón de la tolerancia. Una teoría de competición plantea que la respuesta al NO desde los nitratos orgánicos se ve disminuida en el tejido objetivo, quizás debido a la generación del NO y a los subproductos de la reacción, que finalmente inhiben la respuesta al NO, o debido a que la activación aguda de la ruta del NO tiene un mecanismo de retroalimentación que lo 45 desensibiliza frente una estimulación posterior. Esta teoría se conoce como tolerancia de órgano final. Recientemente se ha propuesto una teoría unificadora que incluye aspectos de la biotransformación de los nitratos orgánicos, así como la de sensibilización de órgano final frente al NO. Esencialmente, la biotransformación de los nitratos orgánicos parece dar como resultado unos niveles mayores de superóxido (O2-) en los tejidos. El superóxido reacciona a la velocidad de difusión con el NO para producir peroxinitrito (OONO) . Esta reacción esencialmente atrapa y destruye el NO basal, impidiendo que active la sGC. Unos niveles reducidos de NO dan lugar a una vasoconstricción, y el OONO’ es un potente oxidante que daña los tejidos. Un tratamiento prolongado con nitratos orgánicos tales como la GTN puede dar como resultado una hipertensión y daños en los tejidos de los pacientes, y esto puede moderarse mediante la coadministración de antioxidantes tales como ascorbato. Por lo tanto, unos compuestos terapéuticos mejorados para la administración del NO a órganos y tejidos para aliviar una 55 vasoconstricción es una importante meta terapéutica.

Se han realizado algunas investigaciones sobre el uso de vehículos basados en hemoglobina para la administración de NO. Sin embargo, los vehículos basados en hemoglobina están limitados debido a su reactividad con el NO en presencia de O2, que da lugar a la inactivación de los vehículos basados en hemoglobina. El NO reacciona directamente con el O2 que está unido a la hemoglobina para formar metamoglobina y nitrato. Tanto el hierro del grupo hemo como el NO resultan oxidados por los átomos de oxigeno unidos, y la reacción se produce tan rápidamente que no se observa desplazamiento del O2 por parte del NO (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 6.455.676) .

Dado que el NO es producido y consumido de forma continua, existe una renovación natural del NO in vivo. Cuando se administra hemoglobina extracelular, el equilibrio entre la producción y el consumo de NO se ve alterado por

reacciones con la hemoglobina extracelular. La reacción oxidativa entre el NO y el O2 unido a la hemoglobina es irreversible, dando como resultado la destrucción del NO, del O2 y de la hemoglobina. La unión del NO a la hemoglobina sin O2 unido es efectivamente irreversible a una escala de tiempo fisiológica, dado que la semivida para la disociación de la nitrosilhemoglobina es de 5 -6 horas, inactivando así efectivamente la hemoglobina como un vehículo de NO extracelular. Una vez que una molécula de NO reacciona con la hemoglobina, es eliminada del conjunto de moléculas de señalización, provocando así ciertas situaciones adversas. Por ejemplo, la unión del NO a la hemoglobina (con o sin O2 unido) puede impedir la relajación vascular y conducir potencialmente a una hipertensión, lo que se observa en algunas ocasiones después de la administración de ciertas soluciones de hemoglobina extracelular.

El NO también es necesario para mediar en ciertas respuestas inflamatorias. Por ejemplo, el NO producido por el endotelio inhibe la agregación de las plaquetas. Consecuentemente, como el NO es unido por la hemoglobina extracelular (con o sin O2 unido) , la agregación de las plaquetas puede aumentar. Al agregarse las plaquetas liberan potentes compuestos vasoconstrictores tales como tromboxano A2 y serotonina. Estos compuestos pueden actuar

sinérgicamente con los reducidos niveles de NO causados por la captura de la hemoglobina para producir una significativa vasoconstricción. Además de inhibir la agregación de las plaquetas, el NO también inhibe la fijación de los neutrófilos a las paredes celulares, lo que a su vez da lugar a daños en la pared celular. Se han observado daños en las paredes celulares endoteliales con la infusión de ciertas soluciones de hemoglobina. Los vehículos de NO basados en hemoglobina también se ven dificultados por el rápido aclaramiento de la hemoglobina extracelular del

plasma debido a la presencia de receptores para la hemoglobina que eliminan la hemoglobina extracelular del plasma. La hemoglobina extracelular también puede provocar una toxicidad renal, posiblemente debido al agotamiento del NO en los glomérulos, provocando una constricción y la subsiguiente disfunción.

Debido a las limitaciones de las actuales terapias nitrovasodilatadoras, permanece un significativo interés y una necesidad de terapias adicionales o alternativas para la administración de NO. En particular, se necesitan vehículos de NO que produzcan menos tolerancia. Adicionalmente, se desean vehículos de NO con una baja velocidad de inactivación por el NO en presencia de O2, tales como vehículos de NO que tengan una baja reactividad del NO y/o una baja afinidad por el O2. También son necesarios vehículos de NO con unas constantes de disociación del NO o unas velocidades de disociación del NO que sean apropiadas para aplicaciones clínicas o industriales... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO que comprende (i) una cantidad

farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que 5 cualquiera de

(a) la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 x 10-4 s-1 y 10 s-1 a 37 º C, y la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es de al menos 1 μMa 37 º C, o

(b) la constante de disociación del NO de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de aquella de

la hemoglobina alfa humana, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa humana.

2. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 x 10-4 s-1 y 10 s-1 a 37 º C, y en la que la 15 constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es de al menos 1 μM a 37 º C.

3. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la constante de disociación del NO de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de aquella de la hemoglobina alfa humana, y en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10

veces menor que la de la hemoglobina alfa humana.

4. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 .

10. 4 s -1 y 0, 012s -1 a37 º C.

5. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 .

10. 4 s -1 y 10 s -1 a 37 º C, y en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es menor de 700 s -1 .

6. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en la que la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX es de entre 1 .

10. 4 s -1 y 10 s -1 a 37 º C, y en la que la velocidad de autoxidación del grupo hemo de la proteína H-NOX es menor de 1 h -1 a 37 º C.

7. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en la que la velocidad de autoxidación del grupo hemo de la proteína H-NOX es menor de 1 h -1 a 37 º C, y en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es menor de 700 s -1 .

8. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de 40 las reivindicaciones 1 -7, en la que la proteína H-NOX comprende al menos una mutación.

9. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con la reivindicación 8 en la que la mutación está en el bolsillo distal.

10. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, que comprende uno o más liposomas o nanopartículas que comprenden la proteína H-NOX.

11. La composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera 50 de las reivindicaciones 1 -10, en la que la proteína H-NOX está unida covalentemente a otra molécula o fracción, o es parte de una proteína de fusión.

12. Una composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 en la que la composición farmacéutica es para su uso como un vasodilatador. 55

13. Una composición farmacéutica para su uso en medicina como un vehículo de NO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 en donde la composición farmacéutica es para el tratamiento de una hipertensión, de una hipertensión crónica, de una insuficiencia cardiaca, de una insuficiencia renal, de un ictus, de un infarto de miocardio, de una cirugía cardiaca, de una afección vasoconstrictora, de una disfunción eréctil, del estreñimiento o 60 de una obstrucción intestinal.

14. Uso de una proteína H-NOX según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 en la preparación de un medicamento para la administración de NO in vivo a seres humanos, en el que el medicamento comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. El uso de una proteína H-NOX de acuerdo con la reivindicación 14 en el que el medicamento es para el tratamiento de una hipertensión, de una hipertensión crónica, de una insuficiencia cardiaca, de una insuficiencia renal, de un ictus, de un infarto de miocardio, de una cirugía cardiaca, de una afección vasoconstrictora, de una disfunción eréctil, del estreñimiento o de una obstrucción intestinal.