Composiciones de colagenasa G y colagenasa H para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.

Un producto seleccionado del grupo que consiste en una composición y un kit de partes,

en el que el producto comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante con una relación de masa de entre 1:2,5 y 1:3,5.

Composiciones de colagenasa G y colagenasa H para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, biotecnología y medicina, y se refiere a la utilización de colagenasa G y colagenasa H para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno, y las formulaciones que contienen dichas enzimas. En particular, se refiere a la utilización de estas dos enzimas en una proporción de colagenasa G y colagenasa H en una relación de 1:2, 5 y 1:3, 5, preferentemente de 1:3, y a su uso secuencial, administrando primero colagenasa G y luego colagenasa H, o en una utilización simultánea usando un sistema de liberación controlada basado en un gel de ácido hialurónico.

Antecedentes de la invención El colágeno es el principal componente estructural en los mamíferos y constituye una gran proporción del contenido proteico total de la piel y otras partes del cuerpo Numerosos episodios de traumatismos de la piel, tales como quemaduras, cirugías, infecciones y accidentes, se caracterizan frecuentemente por una acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno y por un alto contenido en proteoglucanos. Además de actuar reparando el tejido normal que se ha destruido o dañado, el colágeno también se acumula de forma errática formando fibras, cicatrices y cordones que en determinadas condiciones pueden producir algunas deformaciones (contracturas, cicatrices retráctiles) . El exceso de colágeno se ha atribuido a un desequilibrio entre la síntesis y la degradación de colágeno.

Numerosas enfermedades y estados patológicos se asocian con depósitos de exceso de colágeno y acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno. Dichas enfermedades y condiciones patológicas se han denominado colectivamente como "enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno". Se han usado colagenasas para tratar dichos trastornos que cursan con alteraciones del colágeno.

Las colagenasas son peptidasas que se unen y cortan específicamente a secuencias que contienen aminoácidos Pro-X-Gly-Pro, donde X es normalmente un aminoácido neutro. Estas secuencias se encuentran frecuentemente en el colágeno y raramente se encuentran en otras proteínas, lo que explica la alta especificidad por sustratos de estas enzimas. Adicionalmente, mientras que otras enzimas son capaces de degradar colágeno desnaturalizado, las colagenasas son las únicas enzimas capaces de reconocer específicamente colágeno natural e hidrolizarlo. (Seifter y Harper, 1970. Methods Enzymol. 19, 613-635; Harper, 1980. Ann. Rev. Biochem. 49, 1063-1078; Peterkofsky 1982. Methods Enzymol. 82, 453-471) .

Actualmente, el tratamiento de las enfermedades relacionadas con colágeno se lleva a cabo usando una combinación de colagenasa G y H en una relación 1:1, dichas enzimas se producen por fermentación de Clostridium histolyticum y se purifican cromatográficamente, (WO2007/089851A3) . Algunas de dichas enfermedades relacionadas con la acumulación atípica de colágeno son la enfermedad de Dupuytren (US005589171A) , y enfermedades oftálmicas (US4174389) .

En todos los casos, se presenta la utilización de estas enzimas como una mezcla de colagenasas (Col I y Col II o Col G y Col H) . Esto es porque hasta hoy los procedimientos para obtener estas enzimas han sido por purificación del sobrenadante de cultivo celular total o fermentación de Clostridium histolyticum en forma de medio. En el medio de cultivo total de dichas fermentaciones se obtienen tanto ColG como ColH en el mismo momento en una proporción de 1:1. En etapas adicionales de purificación que usan cromatografía se obtiene una mezcla de ambas enzimas ColG y ColH a fin de ser usada como fármaco, como es el caso de Xiaflex, el primer medicamento basado en colagenasas que se ha aprobado por la FDA para tratar la contractura de Dupuytren.

Xiaflex está presente como un polvo liofilizado que se necesita reconstituir en un disolvente adecuado justo antes de su utilización. La dosis es de 0, 58 mg por inyección en un cordón metacarpofalángico o interfalángico palpable, se administra cada 2 horas en 3 posiciones ligeramente diferentes en el cordón, hasta 3 veces por cordón en intervalos de 4 semanas.

Xiaflex contiene colagenasa AUX-I y colagenasa AUX-II, aisladas y purificadas a partir del medio de fermentación de Clostridium histolyticum.

La colagenasa AUX-I es una cadena sencilla de aminoácidos con peso molecular observado de 114 kilodaltons (kDa) . Pertenece a las colagenasas clase I de Clostridium histolyticum.

La colagenasa AUX-II es una cadena sencilla de polipéptidos con un peso molecular observado de 113 kDa. Pertenece a las colagenasas clase II de Clostridium histolyticum.

Sin embargo, estos tratamientos tienen limitaciones derivadas de la naturaleza del producto final (una solución acuosa de colagenasas AUXI y AUXII reconstituidas) , la fuente de estas enzimas (C. hystoliticum) y la combinación de estas colagenasas G y H en una proporción de 1:1. Todos estos factores hacen del medicamento actual un producto cuya actividad es difícil de controlar, también a causa de la manera en la que se libera en el área afectada, siendo sus efectos secundarios principales:

1. Ruptura del tendón normal en el área de tratamiento.

2. Daño grave en los ligamentos de los dedos a tratar.

3. Reacciones alérgicas derivadas de la penetración del producto en el torrente circulatorio.

4. Problemas de coagulación derivados de la alteración de las membranas basales de los vasos sanguíneos.

5. CRPS (síndrome de dolor regional complejo) ,

6. Edema periférico.

7. Dolor y hematomas.

Estos efectos secundarios derivan principalmente de la invasión a áreas circundantes de la inyección de una solución acuosa de colagenasas. Una vez inyectada la solución acuosa, se podría diseminar libremente a áreas adyacentes produciendo la degradación de tendones sanos, produciendo inmovilidad de articulaciones e incluso extenderse hasta la ruptura de tendones sanos y la ruptura de vasos sanguíneos próximos, creando episodios de hemorragia interna que son dolorosos para el paciente e invasión del producto farmacológico en el flujo sanguíneo.

Por tanto, es necesario encontrar un medicamento, otra alternativa farmacéutica que permita obtener los mismos resultados sin los efectos secundarios observados en los medicamentos actuales.

Descripción de la invención Composición de la invención Los autores de la presente invención han desarrollado una composición que comprende colagenasa G (ColG o AUX-I) y colagenasa H (ColH o AUX-II) , siendo estas colagenasas preferentemente enzimas recombinantes (rColG y rColH) , en una proporción precisa que muestra la mejor actividad sinérgica. Dichas composiciones, adicionalmente, se pueden formular como un gel, a fin de tener determinadas ventajas, tales como la reducción de la dosis (cantidad de enzimas) necesaria, una eficacia aumentada de las composiciones en el área de tratamiento, la reducción de los efectos secundarios típicos observados en otras formulaciones que contienen colagenasas, la mejora de la estabilidad del medicamento y, por ende, la reducción en el número de administraciones necesarias para obtener el efecto terapéutico deseado.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante en el presente documento composición de la invención, que comprende colagenasa G y colagenasa H en una relación de entre 1:2 y

1:4. En otras palabras, la composición de la invención tiene de entre dos a cuatro veces más colagenasa H que colagenasa G, es decir, la relación de masa de las colagenasas es de entre 1:2 y 1:4 (G/H)

Como se muestra en la Fig. 1, las enzimas colagenasas, cuando se administran en una composición en dichas proporciones, muestran un efecto sinérgico fuerte. Este efecto sinérgico se explica debido a la naturaleza de cada una de estas enzimas. Las fibras de colágeno natural son resistentes a la hidrólisis enzimática debido a que tienen una superficie expuesta escasa. Es debido a esta razón por la que, para una fase inicial de hidrólisis, se requiere una enzima con gran afinidad por el colágeno natural, tal como colagenasa G. Esta colagenasa tiene dos regiones específicas para la unión al colágeno (Figura 2) , lo que la hace esencial en una primera fase de hidrólisis.

Una vez que la fibra de colágeno está parcialmente hidrolizada, la fibra es más susceptible de hidrolizarse por otras enzimas colagenolíticas más activas, pero menos específicas tales como el caso de la colagenasa H. La colagenasa H muestra la actividad más alta (Figura 1) ,... [Seguir leyendo]

1. Un producto seleccionado del grupo que consiste en una composición y un kit de partes, en el que el producto comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante con una relación de masa de entre 1:2, 5 y 1:3, 5.

2. El producto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la relación de masa de colagenasa G recombinante con respecto a colagenasa H recombinante es de aproximadamente 1:3.

3. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la colagenasa G recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con un marca 6-histidina situada en el extremo C.

4. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el en que la colagenasa H recombinante 10 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 con un marca 6-histidina situada en el extremo C.

5. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el producto es una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que adicionalmente comprende otro ingrediente activo.

7. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende una o más composiciones en la forma de: emplastos, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gelatina, gel, espuma, polvo, o cualquier combinación de los mismos.

8. El producto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las una o más composiciones están en la forma de un gel.

9. El producto como se define en la reivindicación 8, que comprende ácido hialurónico en concentraciones de entre el 0, 05% y 4%.

10. El producto de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las concentraciones de colagenasas son más altas de 400 CDU/mg de ácido hialurónico.

11. El producto de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las concentraciones de colagenasas oscilan entre 450 25 y 5000 CDU/mg de ácido hialurónico.

12. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el ácido hialurónico tiene un peso molecular entre 500 y 5000 kDa.

13. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso como un medicamento.

14. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso como un medicamento, en el

que el producto es un kit de partes y en el que la colagenasa G recombinante se administra antes de la colagenasa H recombinante.

15. El producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones en el tejido conectivo.

16. El producto para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la enfermedad es fibromatosis.

17. El producto para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la fibromatosis está seleccionada de la lista que incluye: contractura de Dupuytren palmar, la enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la fascia plantar o cicatrices retráctiles.