Composición de sol para biochip de sol-gel para inmovilizar una sonda sobre un sustrato sin tratamiento de la superficie y método para su rastreo.

Un método para el rastreo de una composición de sol para biochips de sol-gel,

que se utiliza para inmovilizar una sonda sobre un sustrato que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, comprendiendo el método las etapas de:

(a) obtener un primer banco de composiciones de sol en el que al menos un monómero de silicato, seleccionado del grupo que consiste en ortosilicato de tetrametilo (TMOS), metiltrimetoxisilano (MTMOS), ortosilicato de tetraetilo (TEOS), etiltrimetoxisilano (ETrEOS), trimetoxisilano (TMS), trimetoxisilicato de metilo (MTMS) y trimetoxisilicato de 3-aminopropilo (3-ATMS), y al menos un aditivo seleccionado del grupo que consiste en silicato de poliglicerilo (PGS), digliceril-silano (DGS), 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPTMOS), uretano óxido de (N-trietoxisililpropil) -O-polietileno (PEOU), glicerol y polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular de 10010.000, se mezclan uno con otro en tampón a diversas relaciones;

(b) salpicar el primer banco de composiciones de sol sobre un sustrato diana que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico;

(c) medir la adherencia, el aspecto, la transmitancia y el tiempo de gelificación de las manchas formadas en la etapa (b), y seleccionar, en base a los resultados de la medición, composiciones, que no muestran el desprendimiento de manchas, incluso cuando se raspan con una punta después del lavado, tienen un diámetro de la mancha d.

10. 800 μm, al tiempo que mantienen una forma circular, muestran una auto-fluorescencia menor que la fluorescencia de fondo, y tienen un tiempo de gelificación de 4-48 horas en un tubo y un tiempo de gelificación de 1-4 horas en las manchas del sustrato, obteniendo con ello un segundo banco de composiciones de sol;

(d) añadir una sonda al segundo banco de composiciones de sol y salpicar el segundo banco que contiene la sonda sobre un sustrato que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico; y

(e) medir la tasa de inmovilización de las manchas para la sonda, y la especificidad entre la sonda y una sustancia diana, y seleccionar, en base a los resultados de la medición, una composición de sol en donde la tasa de inmovilización de la sonda es de al menos 70% y la relación de las señales específicas/señales no específicas de la sonda y la sustancia diana es al menos 3.

Composición de sol para biochip de sol-gel para inmovilizar una sonda sobre un sustrato sin tratamiento de la superficie y método para su rastreo.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método para el rastreo de una composición de sol para los biochips de solgel, que se utiliza para inmovilizar una sonda sobre un sustrato que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de elevado peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, al uso de una composición de sol rastreada por dicho método, y a un biochip de sol-gel que comprende dicha composición de sol inmovilizado sobre el mismo.

TÉCNICA DE ANTECEDENTES

El biochip es un ejemplo representativo de la nueva tecnología que combina tecnología de materiales tal como la nanotecnología (NT) , la biotecnología (BT) , que es contenido y campo aplicado de la tecnología de materiales y la tecnología de información (IT) para analizar una gran cantidad de resultados. El biochip se forma sometiendo a micromatrices de alta densidad diversos tipos de biomateriales sobre una unidad de área de una superficie de un soporte sólido. Las tecnologías de biochips incluyen una tecnología para inmovilizar biomateriales, una tecnología para hacer biocompatible a la superficie del chip, la tecnología de micromatrices de biomateriales, una tecnología de ensayo para llevar a cabo diversas reacciones biológicas en un chip producido, una tecnología para detectar los resultados de la reacción, una ingeniería de proteínas para producir biomateriales a ser inmovilizados y la tecnología de recombinación genética.

Un chip de proteína representativo de los biochips se forma sometiendo intensamente a micromatrices diversas proteínas en una unidad de área de la superficie de un soporte sólido. Al utilizar el chip de proteína, es posible llevar a cabo un experimento para múltiples propósitos, tales como el diagnóstico de enfermedades, rastreo de alto rendimiento (HTS – siglas en inglés) , ensayo de la actividad enzimática y similares, con una pequeña cantidad de muestras.

Ha habido intentos de producir el chip de proteína empleando los mismos principios y factores técnicos que en la producción de chips de ADN, que ya han sido desarrollados y utilizados comúnmente. En general, la mayoría de los chips de ADN comúnmente utilizados se producen inmovilizando ADN en un sustrato de vidrio, cuya superficie ha sido tratada previamente con un material de revestimiento. Cuando el chip de proteína se fabrica de acuerdo con un método similar al utilizado en la producción de chips de ADN, es decir, cuando el chip de proteína se fabrica inmovilizando proteínas sobre un sustrato de vidrio cuya superficie ha sido tratada previamente con un material de revestimiento, es probable que se produzcan diversos problemas debido a la diferencia en las propiedades físicas y químicas entre las proteínas diana a ser inmovilizadas.

Chip de proteína previo se produjo por la inmovilización de proteínas sobre un sustrato de vidrio tratado en superficie y se utilizó para llevar a cabo un simple ensayo de unión. El comportamiento del chip de proteína se determinó por la actividad de la proteína inmovilizada y era difícil trabajar con éxito (MacBeath y Schreiber, Science 289:1760, 2000) . Tales problemas son provocados por la desnaturalización, inactivación y degradación de las proteínas que resultan de la diferencia en las propiedades físicas y químicas inherentes de proteínas.

Con el fin de resolver estos problemas, se han realizado investigaciones y estudios en la tecnología de tratamiento en superficie para la inmovilización de proteínas adecuadas para las características de proteínas que se distinguen de las de ADN y en materiales para la inmovilización de proteínas. Tal investigación y estudios se centran en un método para realizar la inmovilización en la superficie de un chip de proteína al tiempo que se mantiene la actividad de la proteína. Ejemplos de los mismos incluyen un portaobjetos recubierto con hidrogel (PerkinElmer) , chip Versalinx (ProLinx) , chip PDC, que es un biochip disponible comercialmente de Zyomyx, etc.

En particular, el portaobjetos recubierto con hidrogel es una tecnología que utiliza un gel de poliacrilamida tridimensional, en el que un vidrio suizo con una superficie ópticamente nivelada, tratada con silano, se utiliza como un material de base y sobre el mismo se aplica un polímero de acrilamida modificado en la superficie para mejorar la fuerza de unión y la estabilidad estructural de una proteína. En este caso, la proteína se inmoviliza mediante un enlace covalente con un grupo funcional de gel de poliacrilamida. También, el chip Versalinx de Prolinx comprende una monocapa de auto-ensamblaje de poli (L-lisina) -g-poli (etilenglicol) formada sobre una de TiO3, en el que una proteína se inmoviliza sobre la superficie monoestratificada de auto-ensamblaje, con lo cual se puede mejorar la actividad de la proteína. Estos métodos forman una micro-estructura tridimensional e inmovilizan covalentemente proteínas sobre una superficie modificada a fin de mantener las actividades de las proteínas dentro de manchas. Además de estos métodos, también es posible hacer un tipo de chips de micro-pocillos mediante microprocesamiento para producir chips en estado de disolución. En Loh, Med. Device Technol. 10 (1) : 24-30, 1999 se revisan las capacidades y aplicaciones de la modificación de la superficie del plasma en aplicaciones biomédicas. Mientras tanto, un proceso de sol-gel es una tecnología que se ha utilizado para hacer una micro-estructura por microprocesamiento, y, en particular, es una tecnología constituida por formar una red de unión por un proceso suave e inmovilizar biomoléculas dentro de la red de unión por métodos distintos a un enlace covalente, en lugar de fijar químicamente las biomoléculas a un material inorgánico (Gill, I. y Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000) . Biomoléculas, incluidas enzimas, se inmovilizan en una matriz de sol-gel sólida para uso en la producción de biocatalizadores o biosensores (Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997) . Especialmente, la matriz de sol-gel también se utiliza en la detección del desarrollo de color óptico debido a su transparencia y propiedad óptica (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994) . También, se sabe que las biomoléculas no sólo son químicamente estabilizadas, sino también térmicamente estabilizadas cuando se inmovilizan sobre una matriz de sol-gel (Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994) .

El documento WO 2004/099776 describe un soporte de biochip, que consiste en un sustrato que porta al menos una capa porosa de material en una primera cara, en donde la capa está prevista para asegurar la fijación de moléculas biológicas sobre y en el interior de dicha capa, y en donde la capa es una capa delgada de material óptica, preparada mediante un proceso de sol-gel, y un método de injertar moléculas biológicas en la superficie y en el interior de la capa delgada de material preparada por el proceso de sol-gel en la primera cara del soporte de biochip. El documento WO 2004/092250 describe un material biocompatible que comprende una composición obtenida al hidrolizar un compuesto de silicio monomérico que tiene al menos un grupo hidrolizable o condensable fijado al átomo de silicio del compuesto con otro compuesto monomérico que tiene al menos un grupo químicamente reactivo fijado sal átomo de metal o metaloide del compuesto para formar un material compuesto de siloxano híbrido; y el uso del material biocompatible en un dispositivo sensor tal como un biosensor o biochip.

En el caso del biosensor, la reacción sol-gel se utiliza como un método de modelar mediante la formación de una micro-estructura sobre un soporte sólido, así como para la simple inmovilización. En esta memoria, el método de modelar incluye conformar un sol en estado líquido utilizando un molde mediante la dinámica de fluidos, gelatinizar el material conformado y separar el molde para formar un modelo. Por ejemplo, una tecnología designada como tecnología de micro-modelación en capilares (MIMIC – siglas en inglés) es para modelar de sílice mesoscópica (Kim et al., J. Ferment. Bioeng. 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater. 10: 571, 1998;. Schuller et al., Appl. Optics 38:5799, 1999) .. Esta tecnología se puede utilizar en la modelación básica de la ingeniería de micro-fluidos.

Sin embargo, puesto que la actividad de la proteína puede verse afectada por diversos factores tales como el pH, es importante establecer las condiciones para el mantenimiento de la actividad mediante la adición de proteína a partir de su estado de sol en el proceso de sol-gel. Para este propósito,... [Seguir leyendo]

1. Un método para el rastreo de una composición de sol para biochips de sol-gel, que se utiliza para inmovilizar una sonda sobre un sustrato que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, comprendiendo el método las etapas de:

(a) obtener un primer banco de composiciones de sol en el que al menos un monómero de silicato, seleccionado del grupo que consiste en ortosilicato de tetrametilo (TMOS) , metiltrimetoxisilano (MTMOS) , ortosilicato de tetraetilo (TEOS) , etiltrimetoxisilano (ETrEOS) , trimetoxisilano (TMS) , trimetoxisilicato de metilo (MTMS) y trimetoxisilicato de 3-aminopropilo (3-ATMS) , y al menos un aditivo seleccionado del grupo que consiste en silicato de poliglicerilo (PGS) , digliceril-silano (DGS) , 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPTMOS) , uretano óxido de (N-trietoxisililpropil) -O-polietileno (PEOU) , glicerol y polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular de 10010.000, se mezclan uno con otro en tampón a diversas relaciones;

(b) salpicar el primer banco de composiciones de sol sobre un sustrato diana que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico;

(c) medir la adherencia, el aspecto, la transmitancia y el tiempo de gelificación de las manchas formadas en la etapa (b) , y seleccionar, en base a los resultados de la medición, composiciones, que no muestran el desprendimiento de manchas, incluso cuando se raspan con una punta después del lavado, tienen un diámetro de la mancha d.

10. 800 µm, al tiempo que mantienen una forma circular, muestran una auto-fluorescencia menor que la fluorescencia de fondo, y tienen un tiempo de gelificación de 4-48 horas en un tubo y un tiempo de gelificación de 1-4 horas en las manchas del sustrato, obteniendo con ello un segundo banco de composiciones de sol;

(d) añadir una sonda al segundo banco de composiciones de sol y salpicar el segundo banco que contiene la sonda sobre un sustrato que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico; y

(e) medir la tasa de inmovilización de las manchas para la sonda, y la especificidad entre la sonda y una sustancia diana, y seleccionar, en base a los resultados de la medición, una composición de sol en donde la tasa de inmovilización de la sonda es de al menos 70% y la relación de las señales específicas/señales no específicas de la sonda y la sustancia diana es al menos 3.

2. El método para el rastreo de una composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sonda es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en proteínas, oligopéptidos, ácidos nucleicos, sustancias de bajo peso molecular, microorganismo, hongos y materiales medicinales a base de hierbas.

3. El método para el rastreo de una composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en placas de polímeros, metales, obleas de silicio, vidrio y LCD.

4. Uso de una composición de sol para biochips de sol-gel, en donde la composición de sol utilizada para inmovilizar una sonda sobre un sustrato de PMMA que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico comprende:

17, 5-25 partes en peso de TMOS; 5-15 partes en peso de MTMS; 2, 5-15 partes en peso de GPTMOS; 12, 5 partes en peso de HCl 10 mM; 25 partes en peso de agua destilada; 11-13 partes en peso de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 5, 8) ; y 10-15 partes en peso de una disolución de la sonda.

5. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha sonda es proteína.

6. Un biochip de sol-gel, en el que la composición de sol utilizada en una de las reivindicaciones 4 ó 5 está inmovilizada sobre un sustrato de PMMA que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico.

7. Uso de una composición de sol para biochips de sol-gel, en que la composición de sol se utiliza para inmovilizar una sonda sobre un sustrato de PMMA que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, y comprende:

22, 5-25 partes en peso de TMOS; 7, 5-10 partes en peso de MTMS; 2, 5-5 partes en peso de GPTMOS; 12, 5 partes en peso de HCl 10 mM;

partes en peso de agua destilada; 11-13 partes en peso de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 5, 8) ; y 10-15 partes en peso de una disolución de la sonda.

8. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha sonda es proteína.

9. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha proteína es antígeno de VHC.

10. Un biochip de sol-gel, en que la composición de sol utilizada en una de las reivindicaciones 7 u 8 está inmovilizada sobre un sustrato de PMMA que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico.

11. El biochip de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho sustrato es una placa de 96 pocillos.

12. Uso de una composición de sol para biochips de sol-gel, en que la composición de sol, utilizada para inmovilizar una sonda sobre un sustrato de oro que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, comprende:

16, 2-18, 7 partes en peso de TMOS; 3, 7-6, 2 partes en peso de MTMS; 13, 7-16, 2 partes en peso de GPTMOS; 0, 01-20 partes en peso de un adhesivo; 12, 5 partes en peso de HCl 10 mM; 23, 7-24, 5 partes en peso de agua destilada; 11-13 partes en peso de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 5, 8) ; y 10-15 partes en peso de una disolución de la sonda.

13. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho adhesivo es 1010 y/o 1020.

14. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha sonda es proteína.

15. Un biochip de sol-gel, en que la composición de sol utilizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 está inmovilizada sobre un sustrato de oro que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico.

16. Uso de una composición de sol para biochips de sol-gel, en que la composición de sol, utilizada para inmovilizar una sonda sobre un sustrato de silicio que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico, comprende:

5-30 partes en peso de TMOS; 2-35 partes en peso de MTMS; 1-15 partes en peso de GPTMOS; 0, 01-20 partes en peso de un adhesivo; 12, 5 partes en peso de HCl 10 mM; 23, 7-24, 5 partes en peso de agua destilada; 12, 5 partes en peso de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 5, 8) ; y 12, 5 partes en peso de una disolución de la sonda.

17. El uso de la composición de sol para biochips de sol-gel de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha sonda es proteína.

18. Un biochip de sol-gel, en que la composición de sol utilizada en una de las reivindicaciones 16 ó 17 está inmovilizada sobre un sustrato de silicio que no está revestido con un agente de revestimiento sintético de alto peso molecular disuelto en un disolvente orgánico.