Cepa de Lactobacillus plantarum para el control del fuego bacteriano.

La presente invención se refiere a la cepa Lactobacillus plantarum TC92,

así como mutantes de la misma, y al uso de dicha cepa como plaguicida en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae. Aspectos adicionales de la invención se refieren a métodos de obtención de la cepa L. plantarum TC92, composiciones plaguicidas que comprenden dicha cepa y un extracto de L. plantarum TC92 con actividad antagonista frente a E. amylovora que es útil para el control del fuego bacteriano. Por último la invención se refiere a un método de control biológico del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae que comprende tratar estas plantas con la cepa L. plantarum TC92 o el extracto de L. plantarum TC92.

Cepa de Lactobacillus planlarum para el control del fuego bacteriano La presente invención se refiere al campo de los fitosanitarios, concretamente a una nueva cepa de LactobacilJus plantarum y a su uso en el control biológico del fuego bacteriano en frutales de pepita y plantas ornamentales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Entre el 38 y el 42% de las pérdidas de producción de los cultivos a nivel mundial se deben a agentes bióticos (plagas, enfermedades y malas hierbas) . Para controlar dicha problemática, la agricultura convencional utiliza productos fitosanitarios (insecticidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas) , obtenidos mediante síntesis química. Sin embargo, el

impacto de un uso masivo de productos fitosanitarios sintéticos en el medio ambiente y en la salud de los consumidores ha ocasionado una reorientación de la protección de los cultivos hacia un manejo integrado de plagas (MIP) , que supone una estrategia que usa una gran variedad de métodos complementarios: físicos, mecánicos, químicos, biológicos, genéticos, legales y culturales, para el control de las plagas. El MIP aspira a reducir o eliminar el uso de fitosanitarios sintéticos y de minimizar el impacto al medio ambiente.

En el campo de las enfermedades de las plantas, el fuego bacteriano de los frutales de pepita y plantas ornamentales afines, causado por Erwinia amylovora, es una de las enfermedades más antiguas, distribuída por todo el mundo y que causa grandes pérdidas 25 económicas. El control del fuego bacteriano se realiza mediante el tratamiento de las plantas con antibióticos (por ejemplo, estreptomicina o tetraciclina) o bien mediante compuestos derivados de cobre (caldo bordelés, oxicloruro , óxido o hidróxido de cobre) . Sin embargo, en muchos países, en concreto en la Unión Europea, el uso de antibióticos en agricultura no está autorizado. Además, la eficacia de los tratamientos con antibióticos en el control del

fuego bacteriano está limitada por el desarrollo en E. amylovora de resistencia plasmídica. Por otro lado, los compuestos cúpricos presentan un impacto ambiental negativo debido a su toxicidad y acumulación en el medio ambiente.

En este sentido, el nuevo marco legislativo de los productos fitosanitarios en la Unión 35 Europea regulado por la directiva 2009/128/CE y el Reglamento (CE) 1107/2009 del

Parlamento Europeo y del Consejo relativos al uso sostenible y comercialización de los plaguicidas, tiene como objetivo principal la reducción del riesgo del uso de productos fitosanitarios a través de una gestión integrada de plagas y enfermedades , y de la protección del medio ambiente, estableciendo que los medios de lucha fitosanitaria deberán ser preferentemente biológicos y físicos.

Por lo tanto queda claro que existe una presión legislativa y una tendencia en agricultura hacia el uso de medios de protección no basados en plaguicidas de síntesis química. Así, en las nuevas técnicas de protección de plantas se prefiere el uso de productos biológicos, mayoritariamente microorganismos y extractos naturales juegan un papel importante. En el caso del control de las enfermedades causadas por bacterias, como el fuego bacteriano de los frutales y plantas ornamentales, la escasa disponibilidad de productos químicos y sus limitaciones de uso ha estimulado el desarrollo de agentes bioplaguicidas de control biológico como ingredientes activos.

Actualmente a nivel mundial se dispone de algunos productos plaguicidas para el control biológico del fuego bacteriano que incluyen en sus materias activas cepas de diversas bacterias como Pseudomonas ffuorescens A506, Pantoea vagans C9-1 , P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, y B. subtilis 8D170 (Johnson, K. y Stockwell, V.O., "Management of fire blight a case study in microbial ecology", Annu. Rev. Phvtopathol. 1998, vol. 36, pp. 227-248) . En Europa sólo se ha autorizado hasta el momento la cepa de Bacillus subtilis QST713 (Bonaterra A et al, "Prospects and limitations of microbial biopesticides for control of bacterial and fungal pomefruit tree diseases", Trees 2012, vol. 26, pp. 215-226) .

Sin embargo, la tecnología actual de control del fuego bacteriano basada en bioplaguicidas microbianos no está exenta de problemas relacionados con (1) la producción de metabolitos secundarios por parte de la mayoría de las cepas, (2) dudas respecto a su bioseguridad, (3) falta de una adecuada aptitud ecológica para la colonización de las plantas, (4) eficacia menor que la de los antibióticos, y (5) dificultades técnicas en la producción de formulados con una vida útil larga, comparable a la de los productos fitosanitarios convencionales.

En primer lugar, varios de los bioplaguicidas descritos para control biológico del fuego bacteriano exhiben un mecanismo de acción consistente en la producción de metabolitos secundarios como las pantocinas o ciclolipopéptidos. Ejemplos de estos bioplaguicidas son

Pantoea vagans C9-1, P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, y B. subtilis 80170. Sin embargo, se ha encontrado que, en algunos casos, estos metabolitos secundarios presentan cierta toxicidad (Ongena M, et al, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol". Trends Microbiol 2008, vol. 16, pp.115-125) .

Un segundo aspecto está relacionado con la bioseguridad, que tienen en cuenta las autoridades responsables de la aprobación de productos de consumo humano, incluyendo productos fitosanitarios (EPA en USA, EFSA en Europa) , concretamente en relación con la posible patogenicidad oportunista o no oportunista de algunas especies bacterianas como Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans, que han sido citadas como causantes de infecciones y sepsis hospitalarias, consideración que puede ser un obstáculo en la autorización de cepas de estas especies para su uso como agente plaguicida. En la UE, las cepas Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9-1 , P. agglomerans E325 y P. agglomerans P10c no han sido consideradas como QPS ("Qualified presumption of safety" en inglés, que significa presunción cualificada de seguridad, un término similar al conocido GRAS, "gene rally recognized as safe", que significa generalmente reconocido como seguro) , y por lo tanto no están autorizadas para el control biológico del fuego bacteriano.

En otros casos se tiene evidencia de que la capacidad para colonizar y sobrevivir en los órganos del huésped a proteger no es eficiente, lo que requiere aplicaciones a elevada concentración o formulaciones complejas de dichos agentes para conseguir un efecto significativo de control de la enfermedad.

Además, aunque se trata de productos biológicos que presentan ventajas sobre otros productos plaguicidas de síntesis, el hecho de tratarse de organismos vivos implica que las condiciones ambientales y del huésped influyen en su actividad biológica, lo que hace que su eficacia sea en general variable y significativamente inferior a la de los antibióticos de referencia.

Finalmente, la preparación industrial de formulados implica el procesamiento de los cultivos obtenidos por fermentación, para obtener productos deshidratados de larga duración. Dichos procesos requieren etapas de secado que afectan significativamente a la viabilidad de los microorganismos, limitando el rendimiento del proceso, en especial en bacterias Gram negativas como Pseudomonas y Pantoea, las cuales son más sensibles a los tratamientos térmicos y de deshidratación que las Gram positivas.

En vista de las limitaciones mencionadas, queda claro que es deseable proporcionar medios más eficientes para el control biológico del fuego bacteriano en árboles frutales y plantas ornamentales.

EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN

Los inventores han aislado una nueva cepa de bacteria del ácido láctico (SAL) que es muy eficiente en el control del fuego bacteriano y que supera las limitaciones anteriormente citadas. La bacteria de la invención es una cepa perteneciente a la especie Lactobacillus plantarum que ha sido aislada a partir de plantas procedentes de campos de cultivos y entornos naturales de clima mediterráneo.

Así, en un primer aspecto la invención se refiere a la cepa de Laetobaeillus plantarum TC92 15 o mutan tes de la misma.

La cepa LaetobaeiJlus plantarum TC92 de la invención, aislada de plantas de tomate de la región de Girona (Cataluña) fue depositada por el solicitante (Universitat de Girona) de acuerdo con el Tratado de Sudapest el 13.03.2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , situada en el Pare Cientific Universitat de Valencia, Edificio 3 CUE. Catedrático Agustín Escardíno. 9. 46980 Paterna (Valencía) . España. La cepa de Lactobacillus plantarum... [Seguir leyendo]

1. Cepa de Lactobacillus plantarum TC92 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8297, o un mutante de la misma, donde dicho mutante se obtiene utilizando la cepa Lactobacillus plantarum TC92 como producto de partida y además tiene las siguientes propiedades del Lactobacillus plantarum TC92:

(i) actividad antagonista frente a Erwinia amylovora,

(ii) presencia de los genes pln A, pln B, pln e, pln O, pln J, pln K, pln M, plnN, pln 0 , pln P, pln EF y pln I relacionados con la síntesis de plantaricinas, (¡ji) capacidad de colonizar o sobrevivir en la flor, hojas y frutos de las plantas pertenecientes a la familia Rosaceae, y

(iv) capacidad de inhibir infecciones por E. amylovora en flores, frutos y hojas de plantas de la familia Rosaceae.

2. Uso de la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o de un mutante de la misma según se definen en la reivindicación 1, como plaguicida en plantas.

3. Uso según la reivindicación 2, para el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae.

4. Uso según la reivindicación 3 donde las plantas de la familia Rosaceae se seleccionan del grupo que consiste en plantas frutales y plantas ornamentales.

5. Uso según la reivindicación 4 donde las plantas se seleccionan del grupo que consiste en peral, manzano, membrillero, níspero, espino de fuego, serbal, mostajo, acerolo, guillomo, espino albar y durillo.

6. Procedimiento de obtención de células de una cepa Lactobacillus plantarum TC92 o de un mutante de la misma, según se definen en la reivindicación 1, que comprende:

(i) inocular la cepa Lactobacillus plantarum TC92, o un mutante de la misma, en un medio de cultivo seleccionado del grupo que consiste en medios sintéticos, medios de origen vegetal, medios de origen animal, y combinaciones de los mismos

(ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a una temperatura entre 25 y 35 oC, un pH entre 5 y 7, Y una concentración de oxígeno entre 15 y 30%, hasta alcanzar una concentración celular superior a 1) ( 1 0*9 UFC/ml,

(iii) separar las células de Lactobacíllus plantarum TC92 o del mutante de la misma del medio de cultivo, y

(iv) recoger las células de Lactobacillus plantarum TC92 derivadas de la etapa (iii)

7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende llevar a cabo una etapa (v) ,

después de la etapa (iv) , en la que las células se someten a un proceso de 5 deshidratación.

8. Composición que comprende la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un mutante de la misma según se define en la reivindicación 1

9. Composición plaguicida que comprende la cepa Lactobacillus plantarum TC92 según se define en la reivindicación 1 y compuestos aceptables a nivel agrícola .

10. Composición según la reivindicación 9, donde los compuestos aceptables a nivel agrícola se seleccionan del grupo que consiste en fitofortificantes, nutrientes, humectantes, compuestos que mejoran la adherencia, compuestos tamponadores, estabilizantes, antioxidantes, osmoprotectores y protectores solares.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que comprende al menos un 15 plaguicida adicional.

12. Composición según la reivindicación 11 donde el plaguicida adicional se selecciona del grupo que consiste en la cepa Lac/obacillus plan/arum TC54 (depositada en la CECT con el número de acceso CECT 8298) , la cepa LactobaciJ/us plantarum PM411 (depositada en la CECT con el número de acceso CECT 8299) , un antibiótico y un compuesto derivado del cobre.

13. Composición según la reivindicación 12 que comprende Lactobacillus plantarum TC54 y LactobaciJ/us plantarum PM411 .

14. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae.

15. Extracto de una cepa de Lactobacillus plantarum TC92 o de un mutante de la misma, según se definen en la reivindicación 1, dicho extracto siendo obtenible mediante el procedimiento que comprende:

(i) inocular la cepa LactobaciJ/us plantarum TC92 o un mutante de la misma según se definen en la reivindicación 1, en un medio de cultivo 30 apropiado,

(ii) someter el medio de cultivo inoculado con la etapa (i) a una temperatura entre 25 y 35 oC, un pH entre 5 y 7, Y una concentración de oxígeno entre 15 y 30%) , hasta alcanzar una concentración celular superior a 1x 1 0*9 UFC/ml.

(iii) separar las células del medio de cultivo de la etapa (ii) ,

(iv) recoger extracto libre de células, y

(v) someter el extracto de la etapa (iv) a un proceso de concentración.

16. Extracto de Lactobacillus plantarum TC92 o de un mutante de la misma, según la reivindicación 15, donde el proceso de concentración de la etapa (v) se lleva a cabo mediante deshidratación, filtración, ultrafiltración, centrifugación, precipitación o cromatografía.

17. Composición que comprende el extracto de Lactobacillus plantarum TC92 o de un mutante de la misma, según las reivindicaciones 15-16.

18. Composición plaguicida que comprende el extracto de Lactobacillus plantarum TC92 o

de un mutante de la misma, según las reivindicaciones 15-16, y compuestos aceptables a nivel agrícola.

19. Uso de una composición plaguicida según se define en la reivindicación 18 en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae.

20. Método de control biológico del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae que

comprende el tratamiento de las plantas con la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un mutante de la misma según la reivindicación 1, el extracto según las reivindicaciones 1516, la composición según las reivindicaciones 9-13 y/o la composición según la reivindicación 18.