Anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D.

Anticuerpo monoclonal anti-RhD, que es una inmunoglobulina IgG1 tetramérica compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras,

comprendiendo la cadena pesada la secuencia de aminoácidos SEQ IN Nº2, y comprendiendo la cadena ligera la secuencia de aminoácidos SEQ IN Nº4.

Anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D

La invención se refiere a un anticuerpo dirigido frente a Rhesus D (o anticuerpo anti-RhD)

Antecedentes tecnológicos

Se designa comúnmente con el término "Rhesus positivo" o "Rh-positivo" a los sujetos cuyos hematíes se aglutinan con aloanticuerpos dirigidos frente al antígeno D (que es uno de los antlgenos del sistema RH), y con el término "Rhesus negativo" o "Rh-negativo" a los sujetos cuyos hematíes no se aglutinan con estos aloanticuerpos.

La enfermedad hemolítica de los recién nacidos se debe en la mayoría de los casos, a la presencia, en una madre Rh-negatlva, de aloanticuerpos anti-RhD (la alo-inmunización frente a otros antlgenos del sistema RH es mucho más rara), lo que provoca en un feto Rhesus positivo una anemia hemolítica que va a necesitar, bien transfusiones in útero, bien una exsanguinotransfusión en el nacimiento en los casos graves.

La alo-inmunización de la madre ocurre generalmente durante un parto precedente; los hematíes fetales pasan a la circulación materna, e inducen una inmunización si el niño es Rh-positivo.

La prevención de la enfermedad hemolítica de los recién nacidos consiste en la inyección de anticuerpos anti-Rh D, a las mujeres Rhesus negativas, inmediatamente después de un parto o una interrupción del embarazo.

Actualmente, los anticuerpos anti-Rhesus utilizados para este objetivo son ¡nmunoglobulinas policlonales que provienen de donantes voluntarios Rhesus negativos, inmunizados varias veces frente a hematíes Rh-positivos.

Esto plantea problemas, por una parte debido a la necesidad de disponer de voluntarios en número suficiente para responder a las necesidades, y por otra parte debido a los riesgos de contaminación por virus u otros patógenos que podrían estar presentes en las preparaciones de ¡nmunoglobulinas obtenidas a partir de la sangre de los voluntarios.

Aunque se han generado varios anticuerpos monoclonales anti-RhD para reemplazar los anticuerpos policlonales, hasta la fecha ninguno está disponible en clínica (Slbéril et al, Clinical Immunology, 26, 118: 17-179).

El clon T125 producido por las células YB2/ de mieloma de rata (clon designado T125 YB2/), reportado por Sibéril et al, supra (y la solicitud W21/77181), era un candidato prometedor, pero con el riesgo de ser relativamente inestable debido a reorganizaciones intramoleculares.

Resumen de la invención

Los inventores han puesto a punto ahora un nuevo anticuerpo monoclonal anti-RhD, que presenta una estabilidad mejorada.

Este anticuerpo, que es una inmunoglobulina lgG1, contiene una cadena pesada codificada por la secuencia nucleotídica SEQ ID N°1. Más particularmente, el anticuerpo es una inmunoglobulina lgG1 tetramérica compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, comprendiendo la cadena pesada la secuencia de aminoácidos SEQ IN N°2, y comprendiendo la cadena ligera la secuencia de aminoácidos SEQ IN N°4.

Este anticuerpo se designa anticuerpo R593 en la presente descripción.

El anticuerpo R593 se ha obtenido por mutación del anticuerpo designado R297, resultante del clon T125 A2 producido por linfocitos B transformados con EBV. Como el anticuerpo R297, el anticuerpo R593 de la invención es una lgG1 tetramérica compuesta por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras que poseen 32 residuos de cisternas implicados en 16 puentes disulfuro ¡ntra-cadena pesada (4 por cadena), intra-cadena ligera (2 por cadena) e intercadena (4 por cadena). El anticuerpo R593 de la invención se distingue del anticuerpo R297 por un residuo fenilalanina en lugar de un residuo cisterna en la posición 68 de la cadena pesada. Su especificidad antigénica es también buena, y su estabilidad está mejorada, porque ya no es posible ninguna reorganización intramolecular indeseable.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo, en asociación con excipientes farmacéuticamente aceptables.

Preferentemente, la composición comprende un tampón citrato.

Ventajosamente, la composición comprende igualmente un excipiente poliol tal como manitol.

Preferentemente también, comprende un tensioactivo no iónico.

Una composición particularmente preferida comprende el anticuerpo asociado con un tampón citrato 3 mM, pH 6,5, polisorbato 8 o un poloxámero, manitol y NaCI. Un ejemplo de composición comprende un tampón citrato 3 mM, pH 6,5, 4 ppm de polisorbato 8, 17 g/L de manitol y 3,25 g/L de NaCI. Otro ejemplo de composición comprende

un tampón citrato 3 mM, pH 6,5, 4 ppm de polisorbato 8 ó 31 ppm de poloxámero 188, 17 g/L de manitol y 3,25 g/L de NaCI.

Descripción detallada de la invención:

Producción del anticuerpo

El anticuerpo monoclonal de la Invención puede producirse por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, por ejemplo por recomblnaclón en una célula huésped, transformada con uno o más vector(es) que permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias nucleotídicas que codifican la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo. El vector contiene generalmente un promotor, señales de inicio y de terminación de la traducción, así como regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Se mantiene de forma estable en la célula huésped y puede poseer opcionalmente señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos se eligen y optimizan por el experto en la técnica en función del huésped celular utilizado.

Por lo tanto, también se describe un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, comprendiendo dicha cadena pesada la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°2.

Se suministra igualmente un vector de expresión, por ejemplo un vector viral o plasmídico, que comprende un ácido nucleico tal como se define aquí. El vector puede replicarse autónomamente en el huésped elegido, o puede tratarse de vectores integrativos el huésped elegido. Igualmente, es útil un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo. Otro objeto de la invención es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo, tales como se definen aquí.

Dichos vectores se preparan por métodos utilizados habitualmente por el experto en la técnica, y los clones resultantes pueden introducirse en un huésped apropiado por métodos estándar, tales como lipofección, electroporación, utilización de agentes policatiónicos, choque térmico, o métodos químicos.

Igualmente, se describe una célula huésped transfectada con dicho o dichos vectores. El huésped celular puede elegirse entre los sistemas procariotas o eucariotas, por ejemplo células bacterianas pero igualmente células de levadura o células animales, en particular células de mamíferos. Se pueden utilizar igualmente células de insectos o células de plantas.

En otro aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de producción de un anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a) el cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula huésped que expresa una cadena pesada y una cadena ligera tales como se definen aquí; y b) la recuperación de dichos anticuerpos así producidos a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.

Un ejemplo particular de procedimiento de producción es una producción en una célula de insecto, como se describe por ejemplo en la solicitud internacional W96/774. Para esto, un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal, o una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal, secuencia que se pone bajo control transcripcional de un promotor apropiado, por ejemplo, un promotor de baculovirus.

A título de ejemplo de promotores de baculovirus, se citarán los promotores de la poliedrina y de P1 de los baculovirus AcMNPV o SIMNPV, o los derivados de promotores de baculovirus, constituidos por promotores sintéticos o recombinantes, obtenidos a partir de un promotor de baculovirus, y funcionales en células de insectos.

La presente invención suministra igualmente vectores recombinantes, que portan al menos un casete de expresión tal como se ha definido anteriormente; en este marco, la presente invención engloba en particular baculovirus recombinantes que permiten la expresión del anticuerpo R593, así como plásmidos de transferencia que permiten la construcción de dichos baculovirus recombinantes.

Para permitir la expresión simultánea de... [Seguir leyendo]

I. Anticuerpo monoclonal anti-RhD, que es una inmunoglobulina lgG1 tetramérica compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, comprendiendo la cadena pesada la secuencia de aminoácidos SEQ IN N°2, y comprendiendo la cadena ligera la secuencia de aminoácidos SEQ IN N°4.

2. Procedimiento de producción de un anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento las

etapas siguientes: a) el cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula huésped que expresa una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia SEQ ID N°2, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia SEQ ID N°4; y b) la recuperación de dichos anticuerpos así producidos a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.

3. Anticuerpo de la reivindicación 1, a título de medicamento.

4. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1, en asociación con excipientes farmacéuticamente aceptables.

5. Composición según la reivindicación 4, que comprende un tampón citrato.

6. Composición según la reivindicación 4 ó 5, que comprende un tensioactivo no iónico.

7. Composición según una de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende un tampón citrato 3 mM, pH 6,5,

polisorbato 8 o un poloxámero, manitol y NaCI.

8. Composición según la reivindicación 7, que comprende un tampón citrato 3 mM, pH 6,5, 4 ppm de polisorbato 8, 17 g/L de manitol y 3,25 g/L de NaCI.

9. Composición según la reivindicación 7, que comprende un tampón citrato 3 mM, pH 6,5, 31 ppm de poloxámero

188, 17 g/L de manitol y 3,25 g/L de NaCI.

1. Composición según una de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la concentración de anticuerpo es de ,3 g/L.

II. Anticuerpo de la reivindicación 1, para una utilización para la prevención de una alo-inmunización Rhesus de individuos Rhesus negativos.

12. Anticuerpo para una utilización según la reivindicación 11, para la prevención de una enfermedad hemolítica en 25 el recién nacido, por administración a una mujer RhD negativa.

13. Anticuerpo según la reivindicación 1, para una utilización en la prevención o el tratamiento de una Púrpura Trombocitopénica Idiopática (PTI).