Análogos de VEGF y métodos de uso.

Un factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) modificado que comprende al menos una mutación que causa que el VEGF modificado actúe como un antagonista del receptor,

en donde la mutación provoca una disminución en la bioactividad en comparación con VEGF de tipo silvestre, y en donde la mutación es una sustitución de aminoácido básico en una posición correspondiente a la posición 83 de la SEC ID Nº 4, en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en I83K e I83R.

Análogos de VEGF y métodos de uso Campo de la invención

Esta solicitud se refiere al diseño y uso de análogos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) como antagonistas del receptor de VEGF para inhibir o reducir la angiogénesis para el tratamiento de afecciones y enfermedades asociadas con angiogénesis. La solicitud también describe análogos de VEGF que muestran afinidad de unión aumentada al receptor para receptores nativos tales como KDR.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) regulan el desarrollo de vasos sanguíneos y linfáticos. Se producen predominantemente por células endoteliales, hematopoyéticas y estromáticas en respuesta a hipoxia y estimulación con factores de crecimiento tales como factores de crecimiento transformante, interleuquinas y factor de crecimiento derivado de plaquetas.

En mamíferos, los VEGF están codificados por una familia de genes e incluyen VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF- D y factor de crecimiento tipo placentario (PIGF). Proteínas altamente relacionadas incluyen proteínas tipo VEGF codificadas por virus orf mencionadas como VEGF-E y una serie de venenos de serpiente mencionados como VEGF-F. Los VEGF y proteínas relacionadas con VEGF son miembros de la superfamilia génica de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de factores de crecimiento de nudo de cistina. Todos los miembros de la superfamilia génica de PDGF comparten un alto grado de homología estructural con PDGF (véase la solicitud de patente de Estados Unidos 9/813.398.

VEGF-A, VEGF-B y PIGF son predominantemente necesarios para la formación de vasos sanguíneos, mientras que VEGF-C y VEGF-D son esenciales para la formación de vasos linfáticos. La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos y vasos linfáticos por desarrollo desde vasos preexistentes. El proceso se inicia cuando los VEGF se unen a receptores en células endoteliales, la activación de la señalización de las células endoteliales. Las células endoteliales activadas producen enzimas que disuelven orificios diminutos en la membrana vasal que rodea los vasos existentes. Las células endoteliales entonces empiezan a proliferar y migrar a través de los orificios disueltos de los vasos existentes para formar nuevos tubos vasculares (Alberts et al, 1994, Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., Nueva York, N.Y. 1294 pp.).

Se activan tres receptores tirosina quinasa tipo III por los VEGF durante la angiogénesis: tirosina quinasa tipo-fms (Flt-1, también conocido como VEGFR1), el receptor de dominio quinasa o receptor que contiene dominio de inserción quinasa (KDR, también conocido como VEGFR2 y Flk-1) y Flt-4 (también conocido como VEGFR3). El KDR es el receptor predominante en la señalización angiogénica, mientras que Flt-1 está asociado con la regulación de morfogénesis de vasos sanguíneos y Flt-4 regula la linfangiogénesis. Estos receptores se expresan casi exclusivamente en células endoteliales, con unas pocas excepciones tales como la expresión de Flt-1 en monocitos donde media la quimiotaxis (Barleon et al., 1996, Blood. 87: 3336-3343).

Los receptores de VEGF están muy relacionados con los Fms, Kit y receptores de PDGF. Consisten en siete dominios tipo inmunoglobulina (Ig) extracelulares, un dominio transmembrana (TM), un dominio yuxtamembrana regulador, un dominio tirosina quinasa intracelular interrumpido por un péptido corto, el dominio de inserción quinasa, seguido por una secuencia que porta varios restos de tirosina implicados en el reclutamiento de moléculas de señalización cadena abajo. El análisis de mutaciones de los dominios extracelulares de Flt-1 y KDR muestra que el segundo y tercer dominio tipo Ig constituyen el dominio de unión a ligando de alta afinidad para VEGF regulando aparentemente el primer y cuarto dominio Ig la unión a ligando y la dimerización del receptor, respectivamente (Davis-Smyth et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 3216-3222; Fuh et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 11197-1124; y Shinkai et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 31283-31288). Los receptores tirosina quinasa se activan tras la dimerización del receptor mediada por ligando (Hubbard, 1991, Prog. Biophys. Mol. Biol. 71: 343-358; Jiang y Hunter, 1999, Curr. Biol. 9: R568-R571; y Lemmon y Schlessinger, 1998, Methods Mol. Biol. 84: 49-71). La especificidad de la señal de los receptores de VEGF se modula adicionalmente tras el reclutamiento de co-receptores, tales como neuropilinas, sulfato de heparina, integrinas o caderinas.

Las moléculas VEGF interaccionan con uno o más receptores tirosina quinasa durante la angiogénesis. Por ejemplo, VEGF-A actúa predominantemente a través de KDR y Flt-1. VEGF-C y VEGF-D asimismo son ligandos específicos para KDR y VEGFR3. Se cree que PIGF y VEGF-B se unen solamente a Flt-1. Variantes virales de VEGF-E activan KDR. Variantes de VEGF-F interaccionan con VEGFR3 o KDR.

Además de los dos receptores clásicos, hay varios receptores de membrana o solubles que modulan la bioactividad de VEGF y la angiogénesis. Por ejemplo, la neuropilina-1 y la neuropilina-2 interaccionan tanto con KDR como con Flt-1, respectivamente, estimulando la señalización de esos receptores. Se ha demostrado que isoformas de VEGF- A, VEGF-B, PIGF-2 se unen a neuropilina-1 (Soker et al, 1998, Cell. 92: 735-745; Makinen et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 21217-21222; y Migdal et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278). Isoformas de VEGF capaces de interaccionar con neuropilina, es decir, aquellas isoformas con el exón 7 ó 6 y 7, también son capaces de

interaccionar con sulfato de heparina.

Aunque VEGF-A es la mejor caracterizada de las proteínas VEGF, la base molecular de la interacción entre VEGF-A y KDR y Flt-1 aún no está bien comprendida. Aunque VEGFR1 se une a VEGF-A con una afinidad 5 veces mayor que KDR, KDR se considera que es el mayor transductor de efectos angiogénicos de VEGF-A, es decir, mitogenicidad, quimiotaxis e inducción de formación de tubos (Binetruy-Tourniere ef al., supra). Hay, sin embargo, evidencias crecientes de que Flt-1 tiene un papel significativo en la hematopoyesis y en el reclutamiento de monocitos y otras células derivadas de médula ósea que puede centrarse en la vasculatura tumoral y promover la angiogénesis (Hattori et al, 22, Nature Med. 8: 841-849; Gerber et al, 22, Nature. 417: 954-958; y Luttun et al, 22, Nature Med. 8: 831-84). Además, en algunos casos se expresa Flt-1 por células tumorales y puede mediar una señal quimiotáctica, extendiendo de este modo potencialmente el papel de este receptor en crecimiento canceroso (Wey et al, 25, Cáncer. 14: 427-438).

Un único homodímero VEGF-A induce la dimerización de dos receptores KDR y la autofosforilación de sus partes citoplasmáticas. Estudios previos sugirieron que por analogía a hormonas glucoprotéicas, los restos de aminoácidos cargados en los bucles periféricos de VEGF-A también son críticos para proporcionar interacciones electrostáticas de alta afinidad con sus receptores específicos (Szkudlinski et al, 1996, Nat. Biotechnol. 14(1): 1257-63; Fuh et al, supra; Muller et al, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94(14): 7192-7; Keytef al, 1996, J. Biol. Chem. 271(1): 5638- 46). Sin embargo, debe apreciarse que muchas mutaciones en VEGF-A no tienen efecto principal sobre la afinidad de unión del receptor. Mutaciones en los bucles periféricos de VEGF principalmente han provocado pérdida de función. Además, parece no haber sustituciones previas de aminoácidos que aumenten la afinidad de unión de KDR más de 2 veces.

La angiogénesis es responsable de eventos biológicos beneficiosos tales como curación de heridas, reparación de infarto de miocardio, y ovulación. Por otro lado, la angiogénesis también es responsable de causar o contribuir a enfermedades tales como crecimiento y metástasis de tumores sólidos (Isayeva et al, 24, Int. J. Oncol. 25(2):335- 43; Takeda et al, 22, Ann Surg. Oncol. 9(7):61-16); aterosclerosis; neovascularización anormal del ojo observada en enfermedades tales como retinopatía del prematuro, retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, y degeneración macular relacionada con la edad (Yoshida et al, 1999, Histol Histopathol. 14(4): 1287-94; Aiello, 1997, Ophthalmic Res. 29(5):354-62); afecciones inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, y artritis séptica; enfermedad neurodegenerativa (Ferrara, N., 24, Endocr. Rev. 25: 581-611); insuficiencia placentaria, es decir, preclamsia (Ferrara, supra); y enfermedades cutáneas tales como dermatitis, psoriasis, verrugas, malignidad cutánea, úlceras de decúbito, úlceras por estasis, granulomas piogénicos, hemangiomas, sarcoma de Kaposi, cicatrices hipertróficas, y queloides... [Seguir leyendo]

1. Un factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) modificado que comprende al menos una mutación que causa que el VEGF modificado actúe como un antagonista del receptor, en donde la mutación provoca una disminución en la bioactividad en comparación con VEGF de tipo silvestre, y en donde la mutación es una sustitución de aminoácido básico en una posición correspondiente a la posición 83 de la SEC ID N° 4, en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en I83K e I83R.

2. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 1, en donde el antagonista comprende una o más sustituciones adicionales de aminoácidos básicos correspondientes al grupo que consiste en las posiciones 44, 67, 72, 73 y 87 de la SEC ID N°4, en donde la sustitución adicional es una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E72R, E73R, E72K, E73K, E44R, E44K, Q87K, Q87L y E67K.

3. El antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1 y 2 que comprende adicionalmente una o más mutaciones que alteran la unión a neutrofilina-1, y que comprende adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos básicos seleccionadas del grupo que consiste en E44, E67, E72, y Q87 de la SEC ID N° 4.

4. El antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el antagonista comprende una o más sustituciones adicionales de aminoácidos en aminoácidos correspondientes a las posiciones 111-165 de la SEC ID N° 4 que alteran la unión a neurofilina-1, en donde la sustitución está en la posición correspondiente a C146 o C16 de la SEC ID N° 4 y en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en C146S y C16S.

5. El antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el antagonista comprende una o más sustituciones adicionales de aminoácidos que reducen o evitan la escisión por proteasa del antagonista, en donde la una o más sustituciones adicionales de aminoácidos se seleccionan del grupo de posiciones correspondientes a las posiciones A111 y A148 de la SEC ID N°4, en donde la sustitución es una o más seleccionadas del grupo que consiste en A111P y A148P.

6. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 1, en donde el antagonista se expresa como proteína de fusión que comprende una o más subunidades de VEGF, en donde el antagonista del receptor de VEGF comprende adicionalmente una toxina.

7. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 1, en donde el antagonista se expresa como un homodímero o heterodímero, en donde una o ambas subunidades del homodimero o heterodímero contiene al menos una mutación.

8. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 6, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en exotoxina de Pseudomonas (PE), una toxina de Difteria (DT), toxina ricina, toxina abrina, toxina ántrax, toxina shiga, toxina de botulismo, toxina tetánica, toxina de cólera, maitotoxina, palitoxina, ciguatoxina, textilotoxina, batracotoxina, conotoxina alfa, taipoxina, tetrodotoxina, alfa toxina tityus, saxitoxina, anatoxina, microcistina, aconitina, toxinas exfoliatina A, exfoliatina B, una enterotoxina, toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina de Y. pestis y toxina de gangrena gaseosa.

9. El antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 7 y 8, en donde al menos una de dichas subunidades es una subunidad de VEGF-A, una subunidad de VEGF-B, una subunidad de VEGF-C, una subunidad de VEGF-D o una subunidad de PIGF, en donde dicha subunidad de VEGF-A se selecciona del grupo que consiste en VEGFi6s, VEGF-iesb, VEGF12i, VEGF145, VEGF148, VEGF183, VEGFm y VEGF26.

1. El antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1-9, en donde la angiogénesis está al menos parcialmente inhibida.

11. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 1, en donde una o ambas subunidades del VEGF comprenden una modificación para prolongar la semivida, en donde la modificación para prolongar la semivida es una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una extensión N terminal, una extensión C- terminal y pegilación.

12. El antagonista del receptor de VEGF de la reivindicación 1, en donde el antagonista del receptor de VEGF es antagonista del receptor de VEGFi6sb que comprende una o más mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en E44B, E67B, E72B, E73B, y Q87B de la SEC ID N° 13, en donde B es un aminoácido básico.

13. Una composición farmacéutica que comprende el antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1-12.

14. Una composición farmacéutica que comprende el antagonista del receptor de VEGF de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento de un paciente diagnosticado con

a) cáncer, en donde dicho cáncer es un cáncer de tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en de vejiga, mama, hígado, hueso, riñón, colon, ovario, próstata, pancreático, de pulmón, cerebro, y piel; o

b) una enfermedad ocular asociada a angiogénesis, en donde la enfermedad ocular asociada a angiogénesis se

selecciona del grupo que consiste en retinopatía del prematuro, retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, degeneración macular, y neovascularización; o

c) una enfermedad o afección relacionada con angiogénesis, en donde la afección relacionada con angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en hemangiomas, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis séptica, asma, 5 aterosclerosis, fibrosis pulmonar idiopática, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas, meningiomas,

glaucoma neovascular, psoriasis, síndrome de Kaposi, angiofibroma, articulaciones hemofilicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de Osier-Weber, granuloma piogénico, fibroplasia retrolental, esclerodermia, tracoma, enfermedad de von-Hippel-Lindau, patologías de adhesión vascular, sinovitis, dermatitis, infertilidad femenina inexplicada, endometriosis, infertilidad masculina inexplicada, pterigión, heridas, llagas, úlceras cutáneas, úlceras 1 gástricas, y úlceras duodenales.