Alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes.

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen,

que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa,

caracterizados por que

el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

Alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes Son objeto del invento unos mutantes y alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes, que codifican unas variantes de la 2-metilcitrato deshidratasa (EC: 4.2.1.79) y unos procedimientos para la producción de L-lisina mediando utilización de unas bacterias que contienen estos alelos.

Estado de la técnica Los aminoácidos encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales.

Es conocido que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de unas cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de este hecho, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen unos aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a la lisina S- (2-aminoetil) -L-cisteína (AEC) .

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas del género Cor y nebacterium que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos.

El cromosoma de Cor y nebacterium glutamicum fue secuenciado completamente hace algún tiempo (Kalinowski y colaboradores, Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003) ) . El cromosoma de Cor y nebacterium efficiens asimismo ya ha sido secuenciado (Nishio y colaboradores, Genome Res. 13 (7) , 1572-1579 (2003) ) .

Unos correspondientes datos de secuencias se pueden tomar de los bancos de datos públicos. Unos apropiados bancos de datos son, por ejemplo, el Banco de Datos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biología molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido) , el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información sobre biotecnología) (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) , el del Swiss Institute of Bioinformatics (Instituto suizo de bioinformática) (Swissprot, Ginebra, Suiza) , de la Protein Information Resource Database (Base de datos de medios de información sobre proteínas) (PIR, Washington, DC, EE.UU.) y el DNA Data Bank of Japan (Banco de datos de ADN del Japón) (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japón) .

Unas exposiciones recopilativas acerca de la genética, del metabolismo y de la importancia técnica de Cor y nebacterium glutamicum se encuentran en los artículos de Ikeda, de Pfefferle y colaboradores y de Mueller y Huebner en la obra "Microbial Production of L-Amino Acids" (Producción microbiana de L-aminoácidos) (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003) , editorial Springer Verlag, Berlin, Alemania, compilador de edición: T. Scheper) ,

en la edición especial con el título "A New Era in Cor y nebacterium glutamicum Biotechnology" (Una nueva era en la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum) (Journal of Biotechnology tomo 104 (1-3) , (2003) , del Journal of Biotechnology (coordinadores de edición: A. Pühler y T. Tauch) y en la obra "Handbook of Cor y nebacterium glutamicum" (Manual de Cor y nebacterium glutamicum) (coordinadores de edición: L. Eggeling y M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EE.UU. 2005) .

La secuencia de nucleótidos del gen prpD1 que codifica la 2-metilcitrato deshidratasa procedente de Cor y nebacterium glutamicum está disponible entre otros lugares en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información sobre biotecnología) (NCBI) de la National Librar y of Medicine (Biblioteca nacional de medicina) (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de acceso AF434798. Ella 60 puede ser deducida además de la solicitud de patente europea EP 1 108 790 como la secuencia nº 770.

Claes y colaboradores (Journal of Bacteriology 184 (10) , 2728-2739 (2002) ) informan acerca de unas investigaciones genéticas, microbiológicas y bioquímicas en los genes prpD1, prpB1 y prpC1 de Cor y nebacterium glutamicum ATCC 13032.

Para conseguir una mejor claridad, la secuencia de nucleótidos del gen prpD1 (“gen de tipo silvestre”) , que codifica la 2-metilcitrato deshidratasa procedente de Cor y nebacterium glutamicum, de acuerdo con los datos del banco de datos NCBI (acrónimo de National Center for Biotechnology Information = Centro nacional para información de biotecnología) está representada en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de la 2-metilcitrato deshidratasa codificada que se establece a partir de aquella está representada en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican adicionalmente las secuencias de nucleótidos que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream”) .

Misión del invento Los autores del invento se han planteado como misión la de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción mejorada de aminoácidos, en particular de L-lisina, L-triptófano, L-valina, L-isoleucina y L-homoserina.

Descripción del invento Un objeto del invento son unos mutantes producidos o respectivamente aislados de bacterias corineformes, que segregan de manera preferida unos aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, caracterizado por que el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Cor y nebacterium. En el caso del género Cor y nebacterium se prefieren las siguientes especies: 25 Cor y nebacterium efficiens (la cepa del tipo DSM44549) ,

Cor y nebacterium glutamicum (la cepa del tipo ATCC13032)

Cor y nebacterium thermoaminogenes (por ejemplo, la cepa FERM BP-1539) , y

Cor y nebacterium ammoniagenes (la cepa del tipo ATCC6871) ,

siendo muy especialmente preferida la especie Cor y nebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Cor y nebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también por otras denominaciones de especies. A éstos pertenecen, por ejemplo:

Cor y nebacterium acetoacidophilum ATCC127270,

Cor y nebacterium lilium DSM20137,

Cor y nebacterium melassecola ATCC17965

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC127269,

Brevibacterium divaricatum ATCC14020, y

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354.

El concepto de "Micrococcus glutamicus" para Cor y nebacterium glutamicum era asimismo usual.

Las cepas de bacterias corineformes empleadas para las medidas técnicas del invento ya poseen de manera preferida la capacidad de enriquecer el aminoácido deseado en la célula y/o de segregarlo al medio nutritivo circundante y acumularlo allí. Para esto, en lo sucesivo se utiliza la expresión de "producir". En particular las cepas 45 de bacterias corineformes que se emplean poseen la capacidad de enriquecer o respectivamente de acumular ≥ (por lo menos) 0, 25 g/l, ≥ 0, 5 g/l, ≥ 1, 0 g/l, ≥ 1, 5 g/l, ≥ 2, 0 g/l, ≥ 4 g/l o ≥ 10 g/l del aminoácido deseado en ≤ (como máximo) 120 horas, ≤ 96 horas, ≤ 48 horas, ≤ 36 horas, ≤ 24 horas o ≤ 12 horas en la célula o en el medio nutritivo. En este caso se puede tratar de unas cepas, que se habían producido mediante una mutagénesis y una selección, mediante unas técnicas de ADN recombinante o mediante una combinación de ambos métodos.

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes... [Seguir leyendo]

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, caracterizados por que el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

2. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria escogida entre el conjunto que se compone de Cor y nebacterium efficiens, Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium thermoaminogenes y Cor y nebacterium aminogenes, de manera preferida de Cor y nebacterium glutamicum.

3. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados por que se trata de unas bacterias que segregan L-aminoácidos, de manera preferida de unas bacterias que segregan Llisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptófano o L-homoserina.

4. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizados por que el gen comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN que se ha obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, o

por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud correspondiente a 498 L-aminoácidos, o por que el polipéptido codificado desde la posición 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y que contiene L-leucina en la posición 272, o por que el gen comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

5. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que la proteína codificada comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto que se compone de a) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6,

b) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive como máximo 5 inserciones o supresiones de aminoácidos.

6. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados por que el gen comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o de la SEQ ID NO: 7.

7. Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

8. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud de 498 aminoácidos, o por que el polipéptido codificado contiene, desde las posiciones 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o por que el polinucleótido aislado es idéntico a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN que se ha obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, o por que el polinucleótido aislado con una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5 se hibrida en condiciones rigurosas, o por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o por que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, o por que la proteína codificada comprende una secuencia de aminoácidos, escogida entre el conjunto que se compone de a) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6,

b) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive como máximo 5 inserciones o supresiones de aminoácidos.

9. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

10. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que él comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

11. Un polinucleótido aislado, que comprende una molécula de ácido nucleico, que codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la SEQ ID NO: 2.

12. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que él codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o

por que la secuencia de aminoácidos contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, no concerniendo los intercambios conservativos de aminoácidos a la posición 272, o por que el polinucleótido aislado contiene una o varias mutaciones mudas o,

el polinucleótido aislado comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1.504 hasta 1.623 de la SEQ ID NO: 7.

13. Un microorganismo recombinante, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12.

14. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia, de manera preferida del género Cor y nebacterium y de manera especialmente preferida de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

15. Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12.

16. Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 15.

17. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia, de manera preferida

del género Cor y nebacterium y de manera especialmente preferida de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

18. Procedimiento para la producción de L-lisina caracterizado por que a) se fermenta una bacteria corineforme aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria por lo menos una copia de un gen, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, conteniendo el polipéptido L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 272 está contenida L-leucina, y

b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de un mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, o se trata de una bacteria corineforme recombinante, que contiene un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12 o que se había producido mediando utilización del mismo, o por que se aísla o recoge el L-aminoácido, y de manera preferida se purifica.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que se aísla o recoge L-lisina en común con unos componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa (> 0 hasta 100 %) , o por que a) a partir del caldo de fermentación obtenido a partir de la etapa b) de la reivindicación 18 se elimina la biomasa formada en una proporción de 0 a 100 %, y

b) a partir del caldo obtenido en la etapa a) se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método escogido entre el conjunto que se compone de una granulación, una compactación, una desecación por atomización y una extrusión.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado por que al caldo de fermentación, antes o después de la etapa a) , se le añade un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico, o por que a partir del caldo obtenido antes o después de la etapa a) , se elimina agua, o por que el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) filtración del caldo de fermentación, de manera preferida con un filtro de membrana, de tal manera que se obtenga un lodo que contiene una biomasa y un material filtrado,

b) aumento de la concentración del material filtrado, preferiblemente de tal manera que se obtenga un contenido de materiales sólidos de 48 a 52 % en peso,

c) granulación del material concentrado obtenido en la etapa b) , de manera preferida a una temperatura de 50º C a 62º C, y

d) revestimiento del granulado obtenido en la etapa c) con uno o varios del/de los agente (s) de revestimiento (en inglés "coating agent (s) ) .

Figura 1: Plásmido pK18mbosacB_prpD1_P272L