Administración extendida de genes a neuronas motoras mediante inyección periférica de vectores AAV.

Un vector AAV que comprende un gen de interés para uso en un método para administrar dicho gen de interés a neuronas motoras o células gliales mediante inyección intraperitoneal (i.

p.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), preferiblemente inyección intravenosa, de dicho vector AAV a un sujeto, donde dicho vector AAV es:

- un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario, o

- un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario procedente de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9.

Administración extendida de genes a neuronas motoras mediante inyección periférica de vectores AAV

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para administrar genes a células del sistema nervioso central en mamíferos. La invención también se refiere a métodos para tratar trastornos de neuronas motoras en mamíferos a través de la expresión de genes terapéuticos. La invención parte del inesperado descubrimiento de que una inyección periférica de vectores AAV conduce a una circunvalación de la barrera hematoencefálica y a una infección masiva de neuronas motoras, así como de otras células del sistema nervioso central. La invención también se puede usar en cualquier mamífero, incluyendo sujetos humanos.

Introducción

Las enfermedades de las neuronas motoras (NM), tal como la atrofia muscular espinal (AME), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o la enfermedad de Kennedy, son trastornos neurodegenerativos que se caracterizan por la degeneración selectiva de NMs en la espina dorsal, el bulbo raquídeo y/o el córtex motor (Monani 25; Pasinelli y Brown 26); (MacLean, Warne et al. 1996). No existe tratamiento para estas enfermedades, principalmente debido a que la administración de fármacos a NM a través de inyecciones sistémicas está dificultada por la presencia de la barrera hematoencefálica (BBB, del inglés blood-brain-barrier). Esta barrera anatómica y fisiológica está formada por uniones tensadas entre las células endoteliales de los capilares del sistema nervioso central (SNC) y evita el paso fácil de moléculas entre la circulación y el SNC (Scherrmann 22). La administración alternativa a NMs de proteínas recombinantes inyectadas directamente en el parénquima del SNC también es difícil debido a la invasividad del procedimiento quirúrgico, lo que dificulta una potencial aplicación clínica.

El fracaso de la farmacología clásica ha llevado a la comunidad científica a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas basadas, en particular, en tecnología de transferencia de genes usando vectores virales. Sin embargo, los vectores virales convencionales generalmente no atraviesan la BBB, y las primeras estrategias de transferencia génica propuestas incluían la administración ¡ntratecal o inyecciones directas de los vectores en el parénquima de la espina dorsal (Davidson, PNAS 2) (Azzouz, Hottinger et al. 2). Sin embargo, estas estrategias invasivas no consiguieron producir una transducción extendida en el SNC eficiente. También se usó la inyección de los vectores virales en los ventrículos cerebrales con el objetivo de transducir las células epiteliales del plexo coroideo y el epéndimo, que median en la secreción de las proteínas terapéuticas en el fluido cerebroespinal (CSF del inglés cerebrospinal fluid) y posterior difusión a través del parénquima del SNC (Passini y Wolfe 21). Sin embargo, la difusión de las proteínas recombinantes a todo el tejido nervioso dista de ser óptima y, nuevamente, los riesgos potenciales relativos al procedimiento quirúrgico son un obstáculo para la aplicación clínica de este método. Posteriormente se desarrolló una estrategia alternativa no invasiva usando transporte axonal retrógrado de vectores virales a NM mediante inyecciones intramusculares (i.m.). De hecho, vectores génicos tales como adenovirus, vector adeno-asoclado o virus de equlnemia pseudotipados con la glicoproteína G de la rabia (EIAV) fueron transportados a lo largo de los axones de las NM tras inyecciones i.m., y se usaron con éxito para transducir NM inferiores en animales experimentales (Finiels et al., 1995; Kaspar et al., 23; Azzouz et al., 24). Sin embargo, el valor clínico de este método sigue siendo cuestionable debido, concretamente, al gran número tanto de sitios de inyección como de partículas víricas que serían necesarios para dirigirse a NM en patologías que afecten a la mayor parte de las unidades motoras del paciente.

Fu et al. (Molecular Therapy, vol. 8, n°6, 23, p. 911-917) describen la distribución global y la dispersión amplia de la expresión transgénica tras infusión de un vector AAV2 y manitol. Inagaki et al. (Molecular Therapy, vol. 14, n°1, 26, p. 45-53) describen una comparación de la transducción de vectores AAV8 y AAV9 en ratones. Kaspar et al. (Science, vol. 31, n° 5634, 23, p. 839-842) describen la administración de IGF-1 y GDNF mediante transporte retrógrado a neuronas motoras de un vector AAV inyectado intramuscularmente. Boulis et al. (Neurobiology of disease, vol. 14, n° 3, 23, p. 535-541) describen la inyección en nervios periféricos de vectores a AAV para expresar genes terapéuticos en neuronas del SNC.

Con el fin de contrarrestar estas dificultades, nosotros evaluamos la eficacia de la transducción para NM de nuevos serotipos y genomas de AAV tras administración intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) e intraperitoneal (i.p.) en ratones. En particular, comparamos la eficacia de vectores AAV recombinantes de cadena sencilla y auto- complementarios (ssAAV y scAAV, respectivamente) de serotipo 1 y 9 para la mediación de la transducción de SNC en ratones.

Nuestros principales resultados demuestran que los vectores scAAV recombinantes que comprenden una cápside derivada de AAV9 son particularmente efectivos para transducir NMs de espina dorsal tras administración i.v. en ratones. Además, mostramos la viabilidad de este método en un modelo animal de mayor tamaño, un modelo de gato doméstico de AME recesiva autosomal similar a la AME humana de tipo III, asociada a carencias del gen LIX1 (Fyfe et al., 26). Nuestro método también permite transducir otras células del SNC, que incluyen células gliales, neuronas del hipocampo y del núcleo habenular, y astocitos. Esta invención, por tanto, demuestra por vez primera que es posible transferir genes de interés a NMs tras una inyección i.v. individual en ratones de un vector AAV9 de doble cadena auto-complementario o de un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario derivado de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápside

derivada de una cápside de AAV9, logrando una amplia administración génica a la espina dorsal y/u otras células nerviosas, por tanto, ofreciendo nuevas vías para el tratamiento de enfermedades de NMs.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevas composiciones y métodos para la administración de productos terapéuticos al SNC usando vectores AAV recombinantes. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones y métodos para administrar genes a neuronas motoras o células gliales de sujetos mamíferos a través de administración periférica de vectores AAV.

Un objetivo de esta invención, más específicamente, se refiere al uso de un vector AAV9 de doble cadena auto- complementario o de un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de doble cadena auto- complementario derivado de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápside derivada de una cápside de AAV9 que comprende un gen de interés (p.ej., que codifica un producto terapéutico o diagnóstico) para la fabricación de un medicamento para la administración del gen a células del sistema nervioso central, particularmente a células motoras o células gliales, mediante administración periférica de dicho vector AAV a dicho sujeto.

Otro objetivo de esta invención se refiere a un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario o a un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario derivado de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9 que comprende un gen de interés (p.ej., que codifica un producto terapéutico o diagnóstico) para la fabricación de un medicamento para administrar el gen a neuronas motoras de la espina dorsal mediante administración periférica de dicho vector AAV a dicho sujeto.

Un objetivo adicional de esta invención reside en un método para administrar un gen a células del sistema nervioso central, particularmente neuronas motoras o células gliales, en un mamífero, método que comprende la administración al mamífero por ruta periférica de un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario o de un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario derivado de un serotipo de AAV diferente del serotipo de AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9 que comprende dicho gen, permitiendo dicha administración la infección de células del sistema nervioso central, particularmente neuronas motoras o células gliales, mediante dichos vectores AAV y con ello la administración de dicho gen a las células del sistema nervioso central, particularmente neuronas... [Seguir leyendo]

1. Un vector AAV que comprende un gen de interés para uso en un método para administrar dicho gen de interés a neuronas motoras o células gliales mediante inyección intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), preferiblemente inyección intravenosa, de dicho vector AAV a un sujeto, donde dicho vector AAV es:

- un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario, o

- un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario procedente de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9.

2. Un vector AAV que comprende un gen de interés para uso en un método para administrar dicho gen de interés a la espina doral mediante inyección intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), preferiblemente inyección intravenosa, de dicho vector AAV a un sujeto, donde dicho vector AAV es:

- un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario, o

- un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario procedente de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9.

3. Un vector AAV que comprende un gen terapéutico para uso en un método para tratar un trastorno de neurona motora en un sujeto, donde dicho vector se administra mediante inyección intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v ), preferiblemente inyección intravenosa, a dicho sujeto, provocando dicha administración la infección de neuronas motoras o células gliales y la expresión del gen en neuronas motoras o células gliales, donde dicho vector AAV es:

- un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario, o

- un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario procedente de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9.

4. Un vector AAV que comprende un gen terapéutico, para uso en un método para producir una proteína o ARN terapéuticos en neuronas motoras de un sujeto mediante inyección intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v ), preferiblemente inyección intravenosa, de dicho vector, donde dicho vector AAV es:

- un vector AAV9 de cadena doble auto-complementario, o

- un vector AAV pseudotipado que comprende un genoma de AAV de cadena doble auto-complementario procedente de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV9 y una cápsida derivada de una cápsida de AAV9.

5. El vector AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el vector AAV es un vector AAV2/9 que comprende un genoma derivado de AAV2 en una cápsida derivada de AAV9.

6. El vector AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el vector AAV comprende un genoma AAV con defecto de replicación que carece de secuencias víricas codificadoras Repy Cap.

7. El vector AAV de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el gen codifica un ARN terapéutico, o una proteína terapéutica seleccionada entre factores de crecimiento, citocinas, hormonas, neurotransmisores, enzimas, factores anti-apoptóticos, factores angiogénicos y la proteína de supervivencia de neuronas motoras (SMN).

8. El vector AAV de la reivindicación 3 ó de las reivindicaciones 4 a 7 en las partes que dependen de la reivindicación 3, donde el trastorno se selecciona entre enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neuromusculares, dolor, enfermedades lisosomales, traumas, lesiones de médula ósea, cánceres del sistema nervioso, enfermedades desmielinizantes, enfermedades autoinmunes del sistema nervioso, síndromes neurotóxicos, trastornos del sueño.

9. El vector AAV de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la expresión de la proteína terapéutica está controlada por un promotor ubicuo, regulado y/o específico de tejido.

1. El vector AAV de la reivindicación 8, donde el gen codifica la proteína SMN y el trastorno es atrofia muscular espinal (AME).