Vectores universales de integración y de expresión de cloroplastos, plantas transformadas y sus productos.

Un vector universal de integración y de expresión, competente para transformar de forma estable el genoma delcloroplasto de diferentes especies vegetales,

que comprende un casete de expresión que comprende,operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y secuencias de controlsituadas en dirección 5' desde el extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante, paraproporcionar la expresión de la secuencia codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana, y,flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con unasecuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma delcloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadoratranscripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita laintegración estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediantela recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma delcloroplasto diana; en el que dicha secuencia codificante heteróloga codifica proteína de seroalbúmina humana, en elque el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

Vectores universales de integración y de expresión de cloroplastos, plantas transformadas y sus productos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta solicitud se refiere al campo de la ingeniería genética de genomas de plantas, particularmente la ingeniería genética del genoma de plastidios de plantas, tales como cloroplastos, y a la transformación estable del genoma de cloroplastos de cualquier especie vegetal.

CASOS RELACIONADOS

Esta solicitud se refiere en particular a un vector universal de expresión e integración de cloroplastos que es competente para transformar cualquier planta con uno o más genes de interés. La solicitud de patente previa, Serie nº 08/591.407, muestra células vegetales transformadas mediante un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN exógena que se integra establemente (se enlaza covalentemente) en el genoma del cloroplasto de la célula de una planta diana. Las secuencias de ADN “establemente” integradas son aquellas que se heredan a través de la replicación del genoma por células u organismos descendientes. Esta estabilidad se muestra mediante la capacidad para establecer estirpes celulares permanentes, clones, o plantas transgénicas que comprenden una población que contiene el ADN exógeno.

Igualmente, la patente U.S. 5.693.507 (1997) , de Daniell y McFadden, describe tal integración estable por medio de un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN exógeno que codifica un rasgo deseado, y las plantas transformadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Ventajas de la Transformación de Cloroplastos Sobre la Transformación Nuclear.

El carácter atractivo de la transformación del genoma de cloroplastos sobre la transformación del genoma nuclear es atribuible a los serios riesgos que resultan de ésta última. Una preocupación habitual es el escape de genes extraños a través de la dispersión del polen desde las plantas transgénicas del cultivo hasta sus parientes herbáceos. Se ha demostrado que el polen transgénico repartirá genes extraños (transgénicos) a otras plantas sexualmente compatibles (detectado mediante el predominio del gen marcador en la prole cosechada a partir de plantas no transgénicas que se hicieron crecer en el área circundante) . Por ejemplo, se ha observado a distancias variables, en diferentes direcciones, la dispersión de polen desde una parcela de ensayo central, que contiene plantas de algodón transgénicas, hasta plantas no transgénicas circundantes (Lewellyn y Fitt, 1996) ; (Umbeck, P.F. et al., 1991) . Además, las frecuencias de genes marcadores en girasoles salvajes fue, por término medio, alrededor de 28 a 38%; en fresas salvajes, que crecen a 50 metros de un campo de fresas, más del 50% de las plantas salvajes contenían genes marcadores procedentes de fresas cultivadas (King, J., 1996) .

El escape de genes extraños a través del polen es especialmente una preocupación medioambiental seria, en el caso de genes con resistencia a herbicidas, debido a las tasas elevadas de flujo de genes desde los cultivos hasta sus parientes salvajes. La preocupación es que el escape de genes desde los cultivos transgénicos hasta sus parientes herbáceos creará malas hierbas poderosas. En el arroz (Or y za sativa) , se ha observado el flujo de genes desde variedades cultivadas hacia los parientes salvajes, en O. perrennis (Barrett, 1983) y en el arroz rojo (O. sativa; Langevin et al., 1990) . En el sur de los Estados Unidos de América, el arroz rojo se ha convertido en una mala hierba importante debido a que los herbicidas que lo exterminan también exterminan al arroz cultivado. Se pagan menores precios por el arroz cultivado contaminado con arroz rojo. Algunos investigadores han introducido el gen bar que confiere resistencia a glufosinato (Liberty) , en el arroz cultivado, para combatir esta mala hierba (Oard et al., 1996; Sankula et al., 1996) . Sin embargo, debido a la compatibilidad sexual, la introducción de un gen expresado en el núcleo permitirá la transmisión de ese rasgo de resistencia al arroz rojo, vía el polen.

De forma similar, se cruzó colza transgénica, genéticamente manipulada por ingeniería para la resistencia a herbicidas, con un pariente herbáceo, Brassica campestris (mostaza salvaje) , y confirió resistencia a herbicidas incluso en la primera generación del retrocruzamiento en las condiciones de campo (Mikkelson, T. R., et al., 1996) .

La herencia materna de los genes introducidos evita el escape de genes a través del polen. Una solución a este problema son los genes extraños manipulados por ingeniería genética a través de genomas de cloroplastos (que se heredan de forma materna para la mayoría de los cultivos) . También, las enzimas o proteínas diana para la mayoría de los herbicidas (por ejemplo, fotosíntesis o rutas biosintéticas de aminoácidos/ácidos grasos) se encuentran en compartimientos dentro del cloroplasto. Otra ventaja importante de la transformación de cloroplastos es el mayor nivel de expresión de genes extraños debido a un número de copias muy elevado (5000-10.000) de genomas de cloroplastos en las células vegetales. Debido a que la maquinaria transcripcional y de traducción del cloroplasto es de naturaleza procariota, los genes de origen bacteriano resistentes a herbicidas se pueden expresar a niveles extraordinariamente elevados en cloroplastos.

Transformación del Genoma de Cloroplastos.

Las investigaciones tempranas sobre la transformación de cloroplastos se centraron en el desarrollo de sistemas de orgánulos usando cloroplastos intactos capaces de una transcripción y una traducción eficaces y prolongadas (Daniell y Rebeiz, 1982; Daniell et al., 1983) y de la expresión de genes extraños en cloroplastos aislados (Daniell y McFadden, 1987) . Estos experimentos se realizaron con la premisa de que fue posible introducir cloroplastos intactos aislados en protoplastos, y regenerar plantas transgénicas (Carlson, 1973) . El descubrimiento del arma génica como dispositivo de transformación abrió la posibilidad de la transformación directa de plastidios en plantas (Daniell, 1993) . Usando el arma génica, se logró la expresión transitoria de genes extraños en plastidios de dicotiledóneas (Daniell et al., 1990; Ye et al., 1990) , de monocotiledóneas (Daniell et al., 1991) , la expresión prolongada de genes foráneos usando vectores de expresión de cloroplastos que se replican autónomamente (Daniell et al., 1990) , y la integración estable de un marcador seleccionado en el genoma del cloroplasto del tabaco (Svab y Maliga, 1993) . Se obtuvieron plantas de tabaco, resistentes a ciertos insectos, integrando el gen cr y IAc en el genoma de cloroplastos del tabaco (McBride et al., 1995; Patente U.S. 5.451.513) . La transformación estable de plastidios de plantas superiores se ha logrado hasta ahora sólo en el tabaco.

Estudios Anteriores Sobre el Genoma de Cloroplastos.

Hasta la fecha, la integración estable de un gen extraño en el genoma de cloroplastos de una planta superior sólo se ha dado a conocer en el tabaco. Esto se logró con un vector que fue específico para el tabaco y que se obtuvo a partir del genoma de cloroplastos del tabaco, esto es, el vector contenía una secuencia homóloga solamente con el genoma de cloroplastos del tabaco y que no se conservó de forma elevada en los genomas de cloroplastos de otras plantas. Tal vector es inadecuado para transformar de forma estable especies vegetales distintas del tabaco. El único documento publicado de la expresión de genes extraños en una especie vegetal distinta del tabaco es aquel de hojas y embriones de trigo (Daniell et al., 1991) , pero no se logró la integración estable. Nunca se ha dado a conocer la integración estable de un gen extraño en el genoma de cloroplastos de una planta monocotiledónea. Al menos en cereales (monocotiledóneas) , los protocolos de transformación/regeneración desarrollados previamente pueden no ser susceptibles a la transformación de plastidios debido a las ineficacias inherentes en esos sistemas. También, las selecciones secuenciales/en serie (selecciones repetidas) , consideradas importantes para lograr la homoplasmia (Daniell, 1997) , pueden no ser factibles usando esos sistemas de regeneración empleados. El desarrollo reciente de protocolos de transformación/regeneración únicos de maíz (Rudraswamy, 1997) y de arroz (sin publicar) tiene el potencial de mostrar eficacias sustancialmente mayores, y permite más de una ronda de selección durante la regeneración.

Maliga et al., en la patente U.S. 5.451.513, y Svab et al., 1990, proponen una transformación del genoma de plastidios del tabaco mediante una técnica de selección no letal que emplea ADN de plastidio que codifica un fenotipo seleccionable... [Seguir leyendo]

1. Un vector universal de integración y de expresión, competente para transformar de forma estable el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y secuencias de control situadas en dirección 5’ desde el extremo 5’ y en dirección 3’ desde el extremo 3’ de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana; en el que dicha secuencia codificante heteróloga codifica proteína de seroalbúmina humana, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

2. Un vector universal de integración y de expresión, competente para transformar de forma estable el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y secuencias de control situadas en dirección 5’ desde el extremo 5’ y en dirección 3’ desde el extremo 3’ de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana; en el que dicha secuencia codificante heteróloga codifica un anticuerpo recombinante, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

3. Un vector universal de integración y de expresión, competente para transformar de forma estable el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y secuencias de control situadas en dirección 5’ desde el extremo 5’ y en dirección 3’ desde el extremo 3’ de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana; en el que dicha secuencia codificante heteróloga codifica una vacuna, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

4. Un genoma de cloroplasto de una planta diana, transformado de forma estable, activo en la transcripción y en la traducción, genoma de cloroplasto el cual se ha transformado con un casete de expresión que comprende una molécula heteróloga de interés codificada por una secuencia de ADN heteróloga, regulada por secuencia de control para proporcionar expresión de la secuencia de ADN codificada en el genoma de cloroplasto de la planta diana, y ADN de la planta que flanquea cada lado del casete de expresión lo que facilitó la integración estable del ADN en el genoma del cloroplasto diana mediante recombinación homóloga, ADN el cual se hereda a través de la replicación de orgánulos en células hijas, en el que el casete de expresión se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN del genoma del cloroplasto de la planta diana, dicha molécula heteróloga de interés es seroalbúmina humana, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

5. Un genoma de cloroplasto de una planta diana, transformado de forma estable, activo en la transcripción y en la traducción, genoma de cloroplasto el cual se ha transformado con un casete de expresión que comprende una molécula heteróloga de interés codificada por una secuencia de ADN heteróloga, regulada por secuencia de control para proporcionar expresión de la secuencia de ADN codificada en el genoma de cloroplasto de la planta diana, y ADN de la planta que flanquea cada lado del casete de expresión lo que facilitó la integración estable del ADN en el genoma del cloroplasto diana mediante recombinación homóloga, ADN el cual se hereda a través de la replicación de orgánulos en células hijas, en el que el casete de expresión se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN del genoma del cloroplasto de la planta diana, dicha molécula heteróloga de interés es un anticuerpo recombinante, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

6. Un genoma de cloroplasto de una planta diana, transformado de forma estable, activo en la transcripción y en la traducción, genoma de cloroplasto el cual se ha transformado con un casete de expresión que comprende una molécula heteróloga de interés codificada por una secuencia de ADN heteróloga, regulada por secuencia de control para proporcionar expresión de la secuencia de ADN codificada en el genoma de cloroplasto de la planta diana, y 5 ADN de la planta que flanquea cada lado del casete de expresión lo que facilitó la integración estable del ADN en el genoma del cloroplasto diana mediante recombinación homóloga, ADN el cual se hereda a través de la replicación de orgánulos en células hijas, en el que el casete de expresión se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN del genoma del cloroplasto de la planta diana, dicha molécula heteróloga de interés es una vacuna, en el que el vector universal de integración y de expresión se puede usar para transformar plantas de diferentes familias.

7. Una planta o célula vegetal, o su progenie, transformada de forma estable, activa en la transcripción y en la traducción, en la que dicha planta comprende un cloroplasto transformado de forma estable con un vector universal de integración y de expresión según la reivindicación 1, 2 ó 3.