Variantes de glucósido hidrolasas.
Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa,
que tiene un grado de identidad con losaminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma máspreferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, caracterizado por el hecho de que lasecuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a lasposiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC IDn.º: 2, caracterizado por el hecho de que la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 yla variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, caracterizado por elhecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependientede la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad deproducto y estabilidad química.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11167129.
Solicitante: NOVOZYMES, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95616 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: HARRIS, PAUL, CHERRY,Joel, TETER,SARAH, WARD,CONNIE, JONES,AUBREY, YI,JUNG.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/56 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
- C12N9/42 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
- C12P19/14 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa.
PDF original: ES-2424346_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Variantes de glucósido hidrolasas.
Esta invención fue realizada con el apoyo del Gobierno bajo el Subcontrato de NREL No. ZCO-30017-02, Contrato principal DE-AC36-98GO10337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a variantes de una glucósido hidrolasa con una o más propiedades mejoradas en relación a su enzima progenitora, ácidos nucleicos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes y métodos de uso de las variantes.
Descripción de las técnicas relacionadas [0003] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unido covalentemente por enlaces beta-1, 4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos betaenlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasa y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares al azar, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas secuencialmente liberan moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble con enlace beta-1, 4. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.
La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar quemar o verter en terrenos los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los desperdicios sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en el etanol.
Ståhlberg et al., 1996, J. Mol. Biol. 264: 337-349, describen estudios de actividad y estructuras de cristal de mutantes catalíticamente deficitarios de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei. Boer and Koivula, 2003, Eur. J. Biochem. 270: 841-848, revela la relación entre la termoestabilidad y el óptimo de pH estudiado con tipo salvaje y mutante de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei Cel7A.
WO 2004/016760 divulga variantes de una celobiohidrolasa Hypocrea jecorina.
Sería una ventaja en la técnica proporcionar variantes de glucósido hidrolasa con propiedades mejoradas para convertir materiales celulósicos a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Las propiedades mejoradas incluyen perfiles de actividad alterada dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad del pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de glucósido hidrolasas con propiedades mejoradas en comparación con sus enzimas progenitoras.
Resumen de la invención [0009] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad para los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, donde las secuencias de aminoácidos 1 de los polipéptidos difieren de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante ha mejorado propiedades en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, pH actividad, pH estabilidad y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican las glucósido hidrolasas o polipéptidos que tienen actividad de glucósido hidrolasas y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de nucleótidos.
La presente invención también se refiere a métodos para producir variantes de una glucósido hidrolasa progenitora o polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa en una célula huésped.
La presente invención además se refiere a métodos de uso de las variantes de glucósido hidrolasa en detergentes y en la conversión de celulosa a glucosa.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pAJ052. La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pJC106.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pAILo1.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pBANe10.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo2.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pCW026.
La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pNP776G205R.
La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pMJ04.
La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pMJ06.
La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pMJ09.
La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pCW045.
La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pSTM01.
La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pSMKO3.
La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pEJG97.
La Figura 15 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una betaglucosidasa Aspergillus fumigatus SEC ID n.°: 56 y 57, respectivamente) . El péptido señal predicho está subrayado y los intrones predichos están en cursiva.
La Figura 16 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 50° y 65° C.
La Figura 17 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 70° C.
La Figura 18 muestra la hidrólisis de celobiosa por beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 65° C.
La Figura 19 muestra los perfiles de curso temporal de hidrólisis PCS por la cepa de Trichoderma reesei parental RutC30 y la variante de expresión de la cepa 776-M57.
Descripción detallada de la invención [0014] La presente invención se refiere a una variante polipeptídica aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad para los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, donde la secuencia de aminoácidos del polipeptídico difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante ha mejorado propiedades en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, pH actividad, pH estabilidad y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
Definiciones [0015] El término quot;glucósido hidrolasaquot; es definida en la presente como hidrolasas descritas por Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach, in quot;Recent Advances in Carbohydrate Bioengineeringquot;, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society de Chemistr y , Cambridge, págs. 3-12. Ejemplos de glucósido hidrolasas incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, celobiohidrolasa, endoglucanasa y exoglucanasa. En una forma de realización preferida, las glucósido hidrolasas pertenecen a familia 7 tal y como se define por Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, supra.
El término quot;celobiohidrolasaquot; es definido aquí como un 1, 4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) , que cataliza la hidrólisis de enlaces 1, 4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, LA celotetriosa, o cualquier glucosa unida por enlace beta-1, 4 con polímero, que libera celobiosa de los extremos reductores o no reductores de la cadena.. Para fines de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279 y por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156 ; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288 . En la presente invención, se empleó el método de Lever... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, caracterizado por el hecho de que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, caracterizado por el hecho de que la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, caracterizado por el hecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
2. Polipéptido variante según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 es Arg.
3. Polipéptido variante según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 es G205R.
4. Polipéptido variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por el hecho de que el polipéptido variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 94 e 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEQ ID n.°: 2.
5. Polipéptido variante según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que la variante comprende las sustituciones G94S + G205R.
6. Secuencia de nucleótidos aislada que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.
8. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7.
9. Una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.
10. Un método para producir un polipéptido variante con actividad de glucósido hidrolasa, que comprende (a) cultivo de la célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas para la producción de la variante; y (b) recuperación de la variante del medio de cultivo.
11. Una composición detergente que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un surfactante.
12. Un método para degradar biomasa que contiene celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una cantidad eficaz de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y recuperación de la biomasa degradada.
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